重組大腸桿菌發(fā)酵合成廣藿香醇

王禹錫,程萍,李若萱,王沁,周哲敏,周麗

(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

廣藿香醇是一種天然的三環(huán)倍半萜化合物,是廣藿香油的主要成分[1]。廣藿香油在日化品領域應用廣泛,可用于香水、精油的制作[2],也常被用于食品、藥品的分析[3]。廣藿香醇具有抗菌消炎止痛的作用,在治療抑郁癥方面也有一定功效,具有潛在的藥用價值[4-6]。隨著消費意識的提升,人們對廣藿香醇的需求量逐年遞增[7-8]。

目前有3類方法可以合成廣藿香醇,即植物提取法、化學合成法和微生物發(fā)酵合成法。其中,植物提取法是目前生產(chǎn)廣藿香醇的主要方法,然而此種方法需要大量廣藿香植株作為原料,占用農(nóng)用耕地；廣藿香醇的產(chǎn)量和品質(zhì)受地理位置、氣候環(huán)境和植株品質(zhì)影響較大；另外,提取廣藿香醇的過程耗能巨大,不利于環(huán)保[8]?；瘜W合成法雖可以合成純度較高的廣藿香醇,但是步驟繁多,操作復雜,合成成本高,產(chǎn)率卻很低[9],無法應用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。

利用微生物發(fā)酵合成廣藿香醇,具有成本低、利于保護環(huán)境和創(chuàng)造經(jīng)濟效益等優(yōu)勢。目前多數(shù)采用釀酒酵母或者谷氨酸棒桿菌作為宿主菌[8-10]。但截止目前,所有發(fā)酵法合成廣藿香醇的研究仍處于實驗室探索階段,其產(chǎn)量均無法達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。酵母菌內(nèi)含有麥角固醇和類胡蘿卜素合成代謝途徑,競爭利用廣藿香醇前體物質(zhì)法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP),對廣藿香醇產(chǎn)量和純度不利。而大腸桿菌中沒有此類代謝途徑[2,11-12],同時,大腸桿菌遺傳背景清晰,基因操作簡便,營養(yǎng)需求簡單,生長迅速,可通過分批補料方式實現(xiàn)高密度發(fā)酵[13],已廣泛應用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中,有望最大化地實現(xiàn)廣藿香醇發(fā)酵合成。AGUILAR等[2]將甲羥戊酸途徑和廣藿香醇合酶(patchoulol synthase,PTS)在大腸桿菌中進行表達,并優(yōu)化發(fā)酵條件和產(chǎn)物提取條件,首次報道了大腸桿菌廣藿香醇發(fā)酵合成。然而,他們沒有對PTS或者廣藿香醇合成代謝途徑進行深入改造,相關研究將對解析廣藿香醇合成機制以及促進廣藿香醇的大規(guī)模應用具有重要意義。

PTS的表達水平和催化能力是影響廣藿香醇合成的重要因素。然而,PTS在大腸桿菌內(nèi)可溶性表達量很低[14],嚴重影響廣藿香醇的發(fā)酵合成。添加可以增強蛋白溶解性的多肽標簽是提高外源蛋白在大腸桿菌中表達水平的一種策略[15],然而目前尚無利用相關策略提高廣藿香醇發(fā)酵合成的報道。同時,目前仍沒有PTS的晶體結構,因此其催化機制并非完全清晰。根據(jù)其他倍半萜合酶的晶體結構推測,PTS的活性中心主要由DDXXD和NSE/DTE基序組成。DDXXD基序與Mg2+結合,協(xié)助底物形成正確取向；NSE/DTE基序位于DDXXD基序?qū)γ?結合另一Mg2+,影響PTS的底物譜[14,16]。截止目前,仍未有對PTS分子改造獲得催化能力增強的突變酶。

本研究采用大腸桿菌作為宿主菌合成廣藿香醇,在PTS2上添加5種促溶標簽,篩選到1種可以增強PTS2可溶表達且增加廣藿香醇產(chǎn)量的標簽。對廣藿香醇合酶PTS2進行了同源比對和序列分析,分子改造獲得突變株,確定了影響酶活力的關鍵位點。通過對FPP供體代謝途徑進行改造,增強了廣藿香醇合成過程中的底物供應。將篩選獲得的最優(yōu)標簽與改造后的底物供體途徑組合,獲得1株最優(yōu)的重組菌。本結果為以大腸桿菌為宿主合成廣藿香醇提供了一定參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

菌株E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α為本實驗室保藏菌株。質(zhì)粒pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)[17](本文簡寫為pMev),Addgene；pET28a-PTS2質(zhì)粒為本實驗室前期構建。本實驗中所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

續(xù)表1

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

Prime Star Max DNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、In-Fusion組裝試劑盒、DNA Marker、Protein Marker(Broad),寶生物工程(大連)公司；質(zhì)粒小提試劑盒、純化試劑盒、卡那霉素、氯霉素,生工生物工程(上海)股份有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、十二烷,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。

M9培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO46,KH2PO43,NaCl 0.3,NH4Cl 1,葡萄糖 5,MgSO42.0 mmol/L,微量元素液0.1%(體積分數(shù))。

微量元素(g/L)：MnSO4·4H2O 0.5,FeSO4·7H2O 10,CaCl22,(NH4)Mo7O240.1,CuSO4·5H2O 3,Na2B4O7·10H2O 0.2,ZnSO4·7H2O 5.25,溶于0.1 mol/L HCl溶液。

根據(jù)需要,向培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終質(zhì)量濃度為50 mg/L、氯霉素至終質(zhì)量濃度為37 mg/L。

1.3 儀器與設備

PCR儀、凝膠成像儀、蛋白電泳儀,BIO RAD公司；UV 1800 PC型紫外可見分光光度計,上海美普達有限公司；pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；生物傳感分析儀,深圳市西爾曼科技有限公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,日立(HITACHI)公司。

1.4 重組質(zhì)粒的構建

1.4.1 融合標簽改造重組質(zhì)粒的構建

以pET28a-PTS2質(zhì)粒為模板,使用表1中所列T7AF+T7AR等引物,全質(zhì)粒PCR,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中,挑選陽性轉(zhuǎn)化子進行測序驗證,得到重組質(zhì)粒pET28a-PTS2/T7A、pET28a-PTS2/T7A2、pET28a-PTS2/T7A3、pET28a-PTS2/NT11、pET-28a-PTS2/SKIK。

1.4.2 廣藿香醇合酶分子改造重組質(zhì)粒的構建

以pET28a-PTS2質(zhì)粒為模板,以I438VF和I438VR為上下游引物全質(zhì)粒PCR擴增,構建重組質(zhì)粒pET-PTS2/I438V(簡寫為I438V)。分別以pET-28a-PTS2質(zhì)粒為模板,用表1所示相應上下游引物進行全質(zhì)粒PCR擴增,構建突變體質(zhì)粒,重組質(zhì)粒分別簡寫為K28R、K57R、K91R、K102R、K131R、K136R、K191R、K226R、K230R、K333R、K343R、K358R、K389R、K391R、K395R、K399R、K425R、K475R、K478R。

1.4.3 FPP合成途徑的改造重組質(zhì)粒的構建

以本實驗室保藏的pT7P-T7T質(zhì)粒為模板,使用表1中引物T7TF和T7PR,PCR擴增T7 terminator-T7 promoter片段；以pMev質(zhì)粒為模板,用引物T7T-tHMGRR和T7P-MKF,PCR擴增質(zhì)粒骨架,將兩片段使用In-Fusion試劑盒組裝連接,構建重組質(zhì)粒pMev-T7M2。以pMev-T7M2質(zhì)粒為模板,用T7T-pBbA5CR和T7P-atoBF引物,PCR擴增質(zhì)粒骨架,與已獲得的T7 terminator-T7 promoter基因片段In-Fusion組裝連接,構建重組質(zhì)粒pMev-T7M1M2。

1.5 重組菌株發(fā)酵合成廣藿香醇方法

將pMev質(zhì)?；瘜W轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)中,涂布于氯霉素抗性的平板,篩選出陽性轉(zhuǎn)化子,挑取單菌落轉(zhuǎn)接至搖瓶中,培養(yǎng)至OD6000.3～0.4,收集菌體,1 800 V、0.5 ms電擊轉(zhuǎn)化pET28a-PTS2質(zhì)粒。將菌液涂布于卡那霉素和氯霉素雙抗性的平板,挑取陽性轉(zhuǎn)化菌株,獲得供發(fā)酵驗證的重組菌株E.coliBL21(DE3)/pMev+pET28a-PTS2。

含有雙質(zhì)粒的菌株在含有卡那霉素和氯霉素的平板上劃線活化,挑取單菌落接種于50 mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10～12 h。種子液以4%(體積分數(shù))接種量轉(zhuǎn)接到50 mL M9培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為2,補加質(zhì)量濃度為500 g/L葡萄糖溶液3 mL、十二烷10 mL,并補加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,在20 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至96 h,其間每12 h檢測一次發(fā)酵液殘?zhí)呛?并補加葡萄糖,維持糖質(zhì)量濃度大于10 g/L,并用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至7.0左右。

1.6 廣藿香醇的檢測方法

離心收集發(fā)酵液上層十二烷,用乙酸乙酯適度稀釋,并用無水Na2SO4除水,使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。

色譜分離條件：初始柱溫為50 ℃,恒溫1 min；以10 ℃/min的升溫速度升至200 ℃；再以20 ℃/min的升溫速度升至280 ℃,恒溫持續(xù)3 min。

質(zhì)譜條件：選擇掃描m/z為35～300的離子,進樣口溫度為280 ℃,流速為1.2 mL/min,離子源溫度為280 ℃,電離模式為電子電離(60 eV),選擇分流進樣模式,分流比為4.2,進樣量為1 μL,用選擇性反應監(jiān)測進行定量分析。定量母離子m/z為138.2,子離子m/z分別為110.1、95.1和123.1,碰撞能量分別為8、14和10。

2 結果與分析

2.1 廣藿香醇合酶可溶性表達改造

PTS2在大腸桿菌內(nèi)可溶性表達很低[14],嚴重限制了廣藿香醇的產(chǎn)量。添加可以增強蛋白溶解性的多肽標簽是提高外源蛋白在大腸桿菌中表達水平的一種策略[15]。在此,我們利用5種短的融合標簽(圖1-a)來提高PTS2的可溶性表達和廣藿香醇的產(chǎn)量。

雖然有研究表明NT11和SKIK標簽能夠有效地促進難以表達的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達[18-19],本研究在PTS2的N端添加這2種標簽都未能進一步提高廣藿香醇的合成量(圖1-b)。而在C端添加T7A、T7A1、T7A3標簽,明顯減少了PTS2包涵體的形成(圖1-c),并在一定程度上提高了PTS2的可溶性表達。同時,T7A-T7A3標簽的酸性越強,PTS2的可溶性表達量越高。然而,廣藿香醇的產(chǎn)量隨著標簽的酸性增強而逐漸減少(圖1-b),這表明過多的負電荷會降低PTS2的催化活性。與原始PTS2相比,將T7A標簽融合到PTS2上,可有效地將廣藿香醇合成量提高39.74%。

a-不同標簽融合策略；b-融合不同標簽對廣藿香醇合成的影響；c-廣藿香醇合酶融合T7A-T73標簽SDS-PAGE圖譜M-標準蛋白質(zhì)Marker；S-細胞破碎上清液；P-細胞破碎沉淀圖1 融合標簽對廣藿香醇合成的影響Fig.1 The effects of fusion tags on patchoulol synthesis

目前研究中,僅HARTWIG等[14]利用長多肽融合標簽將PTS在大腸桿菌中的可溶性表達提高了40%,然而長多肽標簽往往干擾目的蛋白的功能,需要在表達后切除。本研究表明,僅有22個氨基酸的短肽T7A標簽也能有效提高PTS2的可溶性表達以及廣藿香醇發(fā)酵合成產(chǎn)量。同時,將T7A標簽融合到PTS2的C端,便于在N端進一步融合其他促溶蛋白質(zhì)。該結果為提高PTS可溶表達以及進一步組合多種改造策略提高廣藿香醇發(fā)酵合成水平提供了借鑒。

2.2 廣藿香醇合酶分子改造

2.2.1 基于序列同源性分析的分子改造

目前尚無PTS晶體結構的報道,其催化機制尚不清晰,因此通過理性設計對PTS進行分子改造較為困難,導致關于PTS分子改造也很少有文獻報道,尚未獲得催化活性增強的突變體。然而,具有不同催化活性的PTS自然變異體,可為其分子改造提供素材。例如,廣藿香醇合酶PTS1與PTS2分別來源于廣藿香(Pogostemoncablin)的不同植株,它們的氨基酸序列相似性為96.2%。本課題組前期研究結果顯示PTS2合成廣藿香醇的能力要明顯高于PTS1。

a-氨基酸序列同源比對結果；b-PTS2三維結構；c-PTS2突變體菌株的廣藿香醇產(chǎn)量圖2 I438V和E457A氨基酸突變對廣藿香醇合成的影響Fig.2 The effects of amino acid mutations of I438V and E457A on patchoulol synthesis

利用BLAST軟件搜索與PTS2氨基酸序列相似性高的酶,與PTS1、PTS2氨基酸序列進行比對(圖2-a)。并用SWISS-MODEL在線服務器(https://swissmodel.expasy.org/),以黃花蒿(Artemisiaannua)來源的倍半萜合酶晶體結構為模板(PDB：4fjq.1),對PTS2進行分子建模(圖2-b,廣藿香醇合酶PTS2與A.annua來源的倍半萜合成酶氨基酸序列同源性達到43.12%,表明模擬的模型可信度較高)。分析活性中心附近、氨基酸序列不一致的位點。其中,438位的異亮氨酸(Ile,I)在其他倍半萜合酶對應位置均為纈氨酸(Val,V),因此構建相應I438V突變體,驗證其對廣藿香醇合成的作用。此外,據(jù)推測457位的谷氨酸(Glu,E)可能參與結合Mg2+,Mg2+是輔助結合底物FPP的金屬陽離子,是影響催化活性的關鍵位點,而在有些倍半萜合酶中該位點突變?yōu)椴粠щ姾傻母拾彼?Gly,G),將會影響Mg2+的結合能力,因此將其突變?yōu)楸彼?Ala,A)進行驗證。

發(fā)酵結果如圖2-c所示,I438V突變導致重組菌E.coliBL21(DE3)/pMev+I438V廣藿香醇產(chǎn)量降低為原始菌的38.72%。Ile和Val都為非極性氨基酸,但Val的側(cè)鏈更短,表明Ile的長側(cè)鏈有利于PTS2的酶活性。另一方面,457位Glu殘基突變?yōu)锳la導致廣藿香醇產(chǎn)量顯著降低,表明457位點Glu參與結合Mg2+,突變?yōu)椴粠щ姾傻腁la,影響了與Mg2+的結合。因此,I438對PTS2活性有一定影響,而E457是其關鍵氨基酸位點。

2.2.2 基于表面賴氨酸殘基替換的分子改造

本實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn)將酶分子表面的賴氨酸(Lys,K)殘基替換為精氨酸(Arg,R),可以有效提高酶的熱穩(wěn)定性和酶活力[20-22]。本研究利用該策略對PTS2進行分子改造。將PTS的三維模型提交于GETAREA在線服務器(http://curie.utmb.edu/getarea.html),篩選到19個表面暴露比率大于50%的Lys殘基,結果如表2和圖3-a所示。將這些位點突變?yōu)锳rg,重組菌株發(fā)酵結果如圖3-b所示。

表2 PTS2表面賴氨酸殘基預測Table 2 Prediction of surface lysine residue

所有表面Lys突變?yōu)锳rg的突變體導致了廣藿香醇產(chǎn)量不同程度下降,其中28、136、343位突變導致廣藿香醇幾乎不能合成。Lys和Arg同為堿性氨基酸,但Arg的側(cè)鏈基團要大于Lys,氨基酸替換后的空間位阻改變可能是導致酶活下降的主要原因。28、136、343這3個PTS表面氨基酸位點雖然并不靠近活性中心,也不參與Mg2+的結合,卻對PTS的催化活性有重要作用,后續(xù)實驗可對這3個位點進行更深入的研究。上述結果為深入解析PTS催化機制奠定了基礎。

a-廣藿香醇合酶PTS2表面賴氨酸殘基位置；b-PTS2突變體菌株的廣藿香醇產(chǎn)量圖3 廣藿香醇合酶表面賴氨酸突變?yōu)榫彼釋V藿香醇合成的影響Fig.3 The effects of mutating surface lysine of PTS2 into arginine on patchoulol synthesis

2.3 FPP合成代謝途徑的改造

大腸桿菌自身具有廣藿香醇前體化合物——FPP的合成代謝途徑,但該途徑效率低。FRANCISCO等[2]通過引入pMev質(zhì)粒,在大腸桿菌中過量表達甲羥戊酸代謝途徑,提高了廣藿香醇產(chǎn)量,表明該途徑對廣藿香醇發(fā)酵合成有重要作用。但他們并未對pMev質(zhì)粒上的基因表達進行優(yōu)化,相關研究將有利于進一步提高廣藿香醇合成水平。

pMev質(zhì)粒含有從乙酰-CoA合成FPP代謝途徑的8個基因,以lacUV5啟動子啟動轉(zhuǎn)錄。單啟動子后串聯(lián)的編碼基因較多,排序在后的基因可能表達效果較差,因此將pMev質(zhì)粒上攜帶的8個基因劃分為2個模塊,增強其表達。前3個基因atoB、HMGS、tHMGR編碼的酶將乙酰-CoA催化合成甲羥戊酸,將其劃分為第一模塊(簡寫為M1)；MK、PMK、PMD編碼的酶又將甲羥戊酸催化生產(chǎn)異戊二烯焦磷酸(isopentenylpyrophosphate,IPP),IDI將IPP異構化為二甲基烯丙基焦磷酸,1分子IPP和2分子二甲烯丙基二磷酸(dimethylallylpyrophosphate,DMAPP)在ISPA的催化下縮合形成FPP。將MK、PMK、PMD、idi和ispA劃分為第二模塊(簡寫為M2)。在模塊1和模塊2之間插入T7終止子和PT7啟動子,用來終止模塊1的轉(zhuǎn)錄,并增強模塊2的表達,構建重組質(zhì)粒pMev-T7M2(圖4-a)。用引物YtHMGRF和YMKR 進行PCR驗證,瓊脂糖凝膠電泳驗證圖譜如圖4-b所示,原始質(zhì)粒應獲得152 bp條帶,整合后應為303 bp,表明成功獲得了pMev-T7M2重組質(zhì)粒。進一步,將pMev-T7M2質(zhì)粒上模塊1的啟動子替換為T7強啟動子,構建重組質(zhì)粒pMev-T7M1M2(圖4-a),用YpBbA5CF和YatoBR引物進行PCR驗證,電泳驗證圖譜如圖4-c所示,原始質(zhì)粒應獲得240 bp條帶,整合后應為340 bp,表明成功獲得了pMev-T7M1M2重組質(zhì)粒。

a-插入強啟動子策略；b-pMev-T7M2重組質(zhì)粒PCR驗證電泳圖譜；c-pMev-T7M1M2重組質(zhì)粒PCR驗證電泳圖譜M-DNA Marker；1-對照；2-模塊2啟動子替換；3-對照；4-模塊1啟動子替換圖4 法尼基焦磷酸合成途徑改造Fig.4 The modification of farnesyl pyrophosphate synthetic pathway

重組菌株E.coliBL21(DE3)/pMev-T7M2+pET28a-PTS2和E.coliBL21(DE3)/pMev-T7M1-T7M2+pET28a-PTS2廣藿香醇發(fā)酵結果如圖5所示,表明加強兩個模塊均使廣藿香醇產(chǎn)量有不同程度的提高。兩模塊都使用T7啟動子加強表達后,廣藿香醇產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了55.95%,產(chǎn)量提升效果相較于單模塊增強的重組菌株更為顯著。說明增強FPP合成代謝途徑相關基因的表達,以增加底物的供給,可有效促進廣藿香醇發(fā)酵合成。該結果對發(fā)酵合成其他倍半萜化合物也有一定的借鑒意義。

圖5 法尼基焦磷酸代謝途徑改造對廣藿香醇合成的影響Fig.5 The effects of improving synthetic pathway of farnesyl diphosphate on patchoulol synthesis

2.4 組合策略提高廣藿香醇發(fā)酵合成

將篩選到的有效提高PTS2可溶性表達且能夠增加廣藿香醇產(chǎn)量的質(zhì)粒pET28a-PTS2T7A與最優(yōu)的FPP供體質(zhì)粒pMev-T7M1-T7M2轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中,發(fā)酵驗證組合兩種策略的最優(yōu)結果對廣藿香醇合成的作用。結果如圖6所示,重組菌株E.coliBL21(DE3)/pMev-T7M1M2+pET28a-PTS2/T7A產(chǎn)量比出發(fā)菌株提升了72.22%,達到24.1 mg/L,表明兩種策略的有益結果成功實現(xiàn)了疊加。該結果為組合多種策略提高倍半萜化合物在大腸桿菌中的發(fā)酵合成提供了借鑒。

圖6 最優(yōu)改造策略組合對廣藿香醇合成的影響Fig.6 The effects of combining optimal strategies on patchoulol synthesis

3 結論

本研究在大腸桿菌中對PTS和合成FPP的外源代謝途徑進行了改造。對廣藿香醇合酶PTS2添加T7A促溶標簽,可增強其可溶性表達,使廣藿香醇產(chǎn)量提升39.74%。對構成PTS的氨基酸突變,發(fā)現(xiàn)28位、136位、343位的賴氨酸和457位的谷氨酸是影響酶活力的重要位點,為深入揭示PTS的催化機制提供了借鑒。對PTS的底物合成途徑進行強化,使廣藿香醇產(chǎn)量提升55.95%。進一步疊加促溶標簽改造策略與底物合成途徑強化策略,所獲得的重組菌株比優(yōu)化前的菌株產(chǎn)量提升72.22%。本研究相關改造策略對提高PTS催化能力、優(yōu)化倍半萜化合物合成代謝途徑和進一步提高廣藿香醇產(chǎn)量提供了借鑒。