氟蟲腈單克隆抗體的制備及其在牛乳檢測 中的應用

張二敬，李玉靜，李紫然，趙 麗，劉靜靜，張 靜，趙寶華,，李春生,

（1.河北師范大學生命科學學院，河北 石家莊 050024；2.河北交通職業(yè)技術學院紀檢監(jiān)察處，河北 石家莊 050035；3.河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081）

隨著生活品質的提升，多種乳制品已經出現(xiàn)在日常飲食中，我國對于乳制品的農藥殘留檢測也越來越重視。氟蟲腈是牛乳中的一種農藥殘留，它是一種苯基吡唑類新型高活性殺蟲劑[1]，作用原理是阻礙昆蟲γ-氨基丁酸控制的氯化物代謝[2]。通過此作用原理氟蟲腈不但可以殺死鱗翅目、直翅目害蟲和土壤中鞘翅目害蟲的幼蟲，也可以用于殺滅對菊酯類氨基甲酸類和環(huán)戊二烯類產生抗性的害蟲[3]，而且效果極佳[4]。氟蟲腈通過飼料進入牛體內，牛產乳后進而殘留于牛乳中。長期攝入氟蟲腈對人體的肝臟帶來嚴重不良影響[5]。氟蟲腈經過水解及光解作用產生代謝產物氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈[6]。目前乳制品中氟蟲腈的檢測方法有氣相色譜法[7-10]、氣相色譜-質譜法[11-12]、液相色譜法[13]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[14-16]。 這些方法由于樣品處理復雜、操作繁瑣，在檢測上有一定的弊端。免疫分析技術已成功應用于多種農藥及其代謝物的殘留分析[17-21]，它以抗原和抗體之間的特異性識別、可逆性結合為原理，因具有特異性強、靈敏度高、操作相對簡單、檢測速度快、成本低廉等諸多優(yōu)點而備受矚目，因此氟蟲腈人工抗原的合成及其單克隆抗體的制備對于免疫反應顯得尤為重要。具有高特異性抗體的制備依賴于半抗原分子的合成[22]。本研究利用氟蟲腈分子的化學結構進行一系列反應，將氟蟲腈連接到大分子蛋白上，從而合成人工完全抗原，然后利用合成的人工完全抗原制備單克隆抗體，合成的單克隆抗體用于牛乳中氟蟲腈的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳 蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，氟蟲腈 上海市農藥研究所；牛血清蛋白（bovine serum albumen，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA） 北京索萊寶科技有限公司；HAT培養(yǎng)基添加劑（50×）Hybri-MaxTM、HT培養(yǎng)基添加劑（50×）Hybri-MaxTM、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、碳化二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC）、 免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）亞型檢測試劑盒 美國Sigma公司；胎牛血清 上海生物工程有限公司；辛酸、硫酸銨 國藥集團化學試劑有限公司；BALB/c小鼠 河北醫(yī)科大學實驗動物中心；SP2/0細胞由本研究室保存。

1.2 儀器與設備

電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Multiskom GO酶標儀 美國Bio-Tek公司；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋公司；ND-2000超微量分光光度計 美國Thermo公司；恒溫干燥箱、HH-M4電熱恒溫水浴鍋 上海精宏設備有限公司；漩渦混合器 上海醫(yī)科大學儀器廠；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；D-37520高速冷凍離心機 德國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 人工完全抗原的合成

氟蟲腈-BSA（F-BSA）、氟蟲腈-OVA（F-OVA）人工完全抗原的制備：采用戊二醛法[23]，稱取氟蟲腈標準品20 mg溶解到3 mLN,N-二甲基甲酰胺（N,Ndimethylformamide，DMF）中，加入90 μL體積分數10%的戊二醛溶液，室溫下攪拌10 min，稱為溶液A；分別稱取BSA、OVA各50 mg，用10 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解后加入10 mL硼酸鹽緩沖液（pH 8.6），稱為溶液B；冰浴條件下逐滴將溶液A滴加到溶液B中，攪拌過夜；次日透析即得F-BSA、F-OVA人工完全抗原。

氟蟲腈類似物（FH）-BSA（FH-BSA）、FH-OVA人工完全抗原的制備：稱取氟蟲腈標準品0.3 g，用10 mL丙酮溶解，然后用1 mol/L NaOH調節(jié)pH值到12，室溫下攪拌2 h，用電磁爐水浴加熱4～5 h，室溫冷卻，取上清液用1 mol/L HCl調節(jié)pH值至5、有淡黃色沉淀析出，5 000 r/min離心20 min，棄上清收集沉淀，用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl洗滌2 次，淡黃色沉淀即為FH[23]。以FH為半抗原，采用EDC法[23-25]合成人工完全抗原：稱取EDC 0.012 g，溶于500 μL DMF中，冰浴中加入0.05 g FH攪拌4～6 h，稱為C液；分別取1 mL 5 mg/mL BSA和1 mL 5 mg/mL OVA稱為D液，冰浴條件下將C液逐滴加入到D液中，攪拌過夜；次日透析即得FH-BSA、FH-OVA人工完全抗原。

1.3.2 人工完全抗原的鑒定

1.3.2.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis， SDS-PAGE）

依次將FH-OVA、F-OVA、OVA、蛋白Maker（10～180 kDa）、BSA、F-BSA、FH-BSA稀釋至 1 mg/mL上樣，Maker上樣量5 μL，其余樣品上樣量15 μL，使用12%分離膠、3%濃縮膠，30 V電壓電泳30 min后調至100 V電泳4 h。

1.3.2.2 紫外光譜掃描

使用紫外-可見分光光度計掃描，設置波長為250～400 nm，鑒定F-BSA、F-OVA的合成情況。

1.3.3 單克隆抗體的制備

選取3 只6～8 周齡的正常雌性BALB/c小鼠，每只小鼠用F-BSA人工完全抗原免疫，免疫劑量40 μg，每隔2 周免疫1 次，共免疫3 次，7 d后加強免疫1 次。小鼠眼球取血，用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測小鼠血清抗體效價，選取最佳免疫小鼠，使用聚乙二醇法進行融合，經過3 次亞克隆稀釋，篩選得到最佳的雜交瘤細胞株，腹腔注射小鼠，取腹水采用辛酸-硫酸銨沉淀的方法純化IgG，-20 ℃保存。

1.3.4 單克隆抗體的檢測

1.3.4.1 單克隆抗體質量濃度及效價測定

使用超微量分光光度計檢測抗體質量濃度，采用間接ELISA法測定抗體效價。包被0.05 μg/mL F-OVA人工完全抗原，4 ℃過夜，依次加入制備的單克隆抗體，第1個孔稀釋200 倍，后面依次在前一個孔的基礎上稀釋2 倍，酶標二抗1∶5 000稀釋，37 ℃反應45 min，顯色終止后在酶標儀450 nm波長處讀取吸光度（A450nm）。以下涉及間接ELISA方法步驟均與本節(jié)相同。

1.3.4.2 單克隆抗體亞型測定

使用免疫球蛋白亞型檢測試劑盒測定單克隆抗體的亞型。

1.3.4.3 單克隆抗體親和常數（Ka）測定

采用間接ELISA法測定抗體的Ka，以抗體質量濃度的對數為橫坐標，以A450nm為縱坐標，繪制S型曲線，計算單克隆抗體的Ka[26]。

1.3.4.4 單克隆抗體特異性測定

以氟蟲腈作為對照，以氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜為競爭抗原，測定交叉反應率，用競爭ELISA方法測得氟蟲腈和其他3 種代謝物的半抑制質量濃度（semiinhibitory concentration，IC50），交叉反應率按下式計算。

1.3.4.5 單克隆抗體抑制曲線繪制

采用競爭ELISA方法，單克隆抗體按1∶64 000稀釋，添加不同質量濃度（2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/L）氟蟲腈標準溶液，測定A450nm。沒有加入氟蟲腈標準溶液的孔A450nm記為B0，添加不同質量濃度標準溶液的孔A450nm記為B，以不同標準溶液質量濃度的對數值為x軸，B/B0為y軸，建立抑制曲線。

1.3.5 加標回收率與精密度測定

準確量取1 mL牛乳，加入4 mL乙腈，漩渦混合2 min，4 000×g離心5 min，取上清液，重復提取1 次，將2 次上清液合并，用乙腈定容至10 mL；取2 mL 35 ℃水浴氮吹至干，然后加入2 mL 0.01 mol/L PBS復溶。牛乳中氟蟲腈加標量分別設置為1、2、5 μg/L，每個加標量設6 個平行，采用ELISA法測定，計算加標回收率與精密度。

1.4 數據處理

繪圖及數據處理軟件為Origin和Microsoft Excel 2010。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE結果

由圖1可知，根據SDS-PAGE結果，F(xiàn)-BSA在BSA上方出現(xiàn)條帶，表明抗原合成成功。FH-BSA的條帶明顯比BSA條帶寬，表明抗原合成成功。F-OVA有明顯的條帶滯后于OVA，表明抗原合成成功，而FH-OVA條帶與OVA條帶接近，無法判斷合成結果。

圖1 人工合成抗原SDS-PAGE結果Fig. 1 SDS-PAGE patterns of synthetic antigens

選擇F-BSA和F-OVA，采用紫外光譜掃描進一步鑒定二者的合成情況。

2.2 紫外光譜掃描結果

由圖2可知，氟蟲腈、BSA的最大吸收峰分別位于306.7、283.6 nm波長處，而BSA與氟蟲腈偶聯(lián)形成的F-BSA的最大吸收峰位于289.1 nm波長處，最大吸收峰發(fā)生偏移且介于二者之間，由此可知，合成抗原F-BSA偶聯(lián)成功。氟蟲腈、OVA的最大吸收峰分別位于306.7、285.2 nm波長處，而OVA與氟蟲腈偶聯(lián)形成的F-OVA的最大吸收峰位于287.6 nm波長處，由此可知，合成抗原F-OVA偶聯(lián)成功。

圖2 F-BSA和F-OVA紫外光譜掃描結果Fig. 2 UV absorption spectra of F-BSA and F-OVA

根據實驗結果，后期選用F-BSA免疫小鼠，制備單克隆抗體。

2.3 小鼠血清效價測定結果

小鼠血清效價3 次平行測定結果分別為4.1×105、2.0×105、4.1×105。

2.4 單克隆抗體質量濃度及效價測定結果

融合后篩選出分泌單克隆抗體的3F6雜交瘤細胞株，誘生的腹水經辛酸-硫酸銨沉淀法純化后即為單克隆抗體3F6，用超微量核酸蛋白測定儀測得單克隆抗體3F6質量濃度為8.5 mg/mL，間接ELISA測得效價為2.0×106。

2.5 單克隆抗體3F6亞型測定結果

由圖3可知，雜交瘤細胞3F6分泌的單克隆抗體3F6與不同亞類的二抗顯色結果不同，與IgG1二抗的顯色度最高，與IgM的二抗有微弱的顯色，而與IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA的二抗幾乎不顯色，所以單克隆抗體3F6亞型為IgG1。

圖3 單克隆抗體3F6亞型Fig. 3 Subtype composition of monoclonal antibody 3F6

2.6 單克隆抗體3F6 Ka測定結果

由圖4可知，采用間接ELISA法測定單克隆抗體3F6的Ka，繪制S型曲線，根據Ka公式計算得Ka=4.6×1010L/mol。

圖4 單克隆抗體3F6的KaFig. 4 Ka of monoclonal antibody 3F6

2.7 單克隆抗體3F6特異性測定結果

以交叉反應率來表征抗體的特異性。由圖5可知，以氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜為競爭抗原，氟蟲腈作為對照，采用ELISA方法測定，其交叉反應率分別為9.21%、21.46%、14.02%，說明制備的單克隆抗體3F6特異性良好。

圖5 交叉反應率測定結果Fig. 5 Cross-reaction rates

2.8 單克隆抗體3F6抑制率測定結果

由圖6可知，在0.125～2.000 μg/L質量濃度范圍內，線性關系良好（R2=0.994 1），單克隆抗體3F6的IC50為0.32 μg/L，對氟蟲腈具有較高的敏感性。

圖6 單克隆抗體3F6對氟蟲腈的抑制率Fig. 6 Inhibition rate of monoclonal antibody 3F6 on fipronil

2.9 加標回收率與精密度

由表1可知，批內與批間加標回收率為87.00%～118.00%，變異系數在15%以內，表明方法具有較高準確度和精密度。

表1 樣品加標回收率和變異系數（n=6）Table 1 Recoveries and coefficients of variation for spiked samples (n = 6)

3 結 論

根據氟蟲腈的分子結構，用戊二醛法和EDC法合成氟蟲腈人工完全抗原，對抗原進行SDS-PAGE鑒定，結果表明，F(xiàn)-BSA、FH-BSA抗原合成成功，F(xiàn)-OVA有明顯的條帶在OVA條帶上方，表明抗原合成成功，而FH-OVA條帶與OVA條帶接近，無法判斷合成結果。對氟蟲腈人工完全抗原F-BSA、F-OVA進行紫外光譜鑒定，結果顯示，BSA與氟蟲腈偶聯(lián)形成的F-BSA的最大吸收峰位于289.1 nm波長處，OVA與氟蟲腈偶聯(lián)形成的F-OVA的最大吸收峰位于287.6 nm波長處，抗原F-BSA、F-OVA偶聯(lián)成功。

運用小鼠腹內誘生腹水的方法得到氟蟲腈單克隆抗體3F6，其質量濃度為8.5 mg/mL，間接ELISA法測得效價為2.0×106，亞型檢測試劑盒測得單克隆抗體3F6亞型為IgG1，間接ELISA法測得單克隆抗體3F6的Ka為4.6×1010L/mol，與氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜的交叉反應率分別為9.21%、21.46%、14.02%。建立氟蟲腈的抑制曲線，結果顯示，在0.125～2.000 μg/L質量濃度范圍內，線性關系良好（R2=0.994 1），IC50為0.32 μg/L，單克隆抗體3F6對氟蟲腈具有較高的敏感性。

牛乳中氟蟲腈加標量分別為1、2、5 μg/L時，每個加標量設6 個平行，批內與批間回收率為87.00%～118.00%，變異系數在15%以內，本研究方法具有較高準確度和精密度。