不同提取條件對(duì)黃連中小檗堿含量的影響

張小斌，雷艷妮，陳書(shū)存

(1.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院商洛中藥材GAP科研工程中心,陜西 商洛 726000；2.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西商洛 726000；3.商洛市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 商洛 726000)

黃連屬毛莨科植物(Cop tisch inen sis Franch)、三角葉黃連(Coptis deltoid ea C1Y1Cheng etH siao)、云南黃連(Coptis teetaWall)的干燥根莖，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中有很高的藥用價(jià)值，是植物藥材中的上品。根莖性質(zhì)屬寒，味道較苦，對(duì)于調(diào)節(jié)人體心脾肝胃等器官有很大的良性作用，人們最常用黃連來(lái)去火，利用的就是它清心除煩、瀉火解毒的功效[1]。黃連含有的成分較為復(fù)雜，其中人們常用的就是黃連堿、非洲防己堿等，小檗堿在所有成分中含量最高，約為3%～9%[2]，藥理研究表明小檗堿具有顯著的抗腫瘤作用、對(duì)糖尿病、腸道、心血管均有作用，抗腦缺血，抗血小板、抗炎、抗腦缺血等作用[3～7]。目前小檗堿提取方法主要有滲漉法、有機(jī)溶劑法、浸漬法、水提取法、稀硫酸法[8]等。筆者采用回流提取法，不僅效率較高，可以減少提取過(guò)程投入的時(shí)間與人力投入，還可以深入研究鹽酸小檗堿的提取過(guò)程優(yōu)劣之處，鹽酸小檗堿作為黃連的有效成分，研究過(guò)程應(yīng)該重點(diǎn)完善其提取過(guò)程，通過(guò)改變影響提取的主要因素—溶劑濃度和提取時(shí)間來(lái)分別采用紫外分光光度計(jì)法[9]測(cè)定黃連中小檗堿的含量，優(yōu)選最佳提取條件，給我國(guó)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域黃連資源的開(kāi)發(fā)制造更多助推力，提供更多具有較高價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 藥材與試劑

藥材: 目前，黃連飲片的供給方為商洛國(guó)藥控股企業(yè)，經(jīng)商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院制藥工程系鑒定為毛茛科植物黃連(Cop tisch inen sis Franch)的干燥根莖。

試劑：小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào) 110713-201212，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇(利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司)、無(wú)水乙醇(利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司)、95%乙醇(利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司)、鹽酸(西隴化工股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

755B紫外可見(jiàn)光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；石英比色皿；電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)HHS-11-2);索氏提取器；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ))；移液管(0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL)、10 mL容量瓶若干、100 mL容量瓶若干、吸耳球、濾紙(9 cm)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 不同條件黃連中小檗堿的提取

(1)精密稱取黃連粉末10 g，以濾紙包裹放進(jìn)專業(yè)提取器里，常用的提取器為索氏提取器，量取無(wú)水乙醇與鹽酸比例為100∶1的溶劑100 mL置于250 mL的圓底燒瓶中，在80 ℃水浴鍋中回流提取，提取時(shí)間分別設(shè)定為1 h、2 h、3 h。

(2)精密稱取黃連粉末10 g，同上采取相同處理方法，量取95%乙醇與鹽酸比例為100∶1的溶劑100 mL置于250 mL的圓底燒瓶中，在80℃水浴鍋中回流提取，提取時(shí)間分別設(shè)定為1 h、2 h、3 h。

(3)精密稱取黃連粉末10 g，以濾紙包裹采用同上的相同處理方法，量取75%乙醇與鹽酸比例為100∶1的溶劑100 mL置于250 mL的圓底燒瓶中，在80℃水浴鍋中回流提取，提取時(shí)間分別設(shè)定為1 h、2 h、3 h。

2.2 含量測(cè)定方法

2.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 將稱取量定為兩毫克，稱取對(duì)象為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸小檗堿，將足量的鹽酸小檗堿放于容量瓶中，容量瓶量程為50 mL，采用水浴加熱的方法使鹽酸小檗堿充分溶解。放冷，加甲醇至刻度，以甲醇為空白溶液，波長(zhǎng)范圍為300～600 nm，在該范圍內(nèi)掃描溶液，掃描結(jié)果表明，當(dāng)波長(zhǎng)為345 nm時(shí)，溶液的吸收峰最大，因此選擇345 nm作為鹽酸小檗堿的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.2 制備鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液 使用專業(yè)手法稱取標(biāo)準(zhǔn)鹽酸小檗堿，稱取質(zhì)量為10 g，將稱取后的鹽酸小檗堿放于容量瓶里，容量瓶量程選為250 mL，同樣進(jìn)行水浴加熱處理使得鹽酸小檗堿可以充分溶解，放冷，加甲醇至刻度，制成濃度為0.040 mg·mL-1的溶液，放置一旁作為備用品。用精密儀器從溶液中量取小劑量試劑，從1 mL到5 mL，將這五種劑量的溶液均放置在容量瓶中，容量瓶量程選為10 mL，用甲醇定容至刻度，待測(cè)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取已配置好濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白對(duì)照溶液選擇甲醇溶液，測(cè)定當(dāng)掃描波長(zhǎng)為345 nm時(shí)送我的的吸光度。將測(cè)量結(jié)果繪制出函數(shù)曲線，縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為溶液濃度。

表1 鹽酸小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.4 制備實(shí)驗(yàn)所需供試品溶液 保證精確度的前提下，量取上述黃連提取液0.1 mL，放于容量瓶中，容量瓶量程選為100 mL，向容量瓶中添加甲醇直到溶液達(dá)到刻度線處，搖晃均勻。以無(wú)水乙醇1 h為起始，75%乙醇3 h為終止編號(hào)(1、2、3、4、5、6、7、8、9)。

2.2.5 供試品溶液的含量測(cè)定 精密量取一定量制備好的鹽酸小檗堿供試品溶液9份，將甲醇作為實(shí)驗(yàn)的空白溶液，采用方法為紫外分光光度法，在345 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并且將鹽酸小檗堿的含量計(jì)算出來(lái)。

計(jì)算方式：

A=49.993C+0.0289，含量M測(cè)=(C×V1×V2)/1000，W(%)=(M測(cè)/M稱)×100%(V1:提取液的體積；V2:吸取0.1mL溶液稀釋體積)

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取75%乙醇提取3 h的提取溶液0.1 mL，將其放于容量瓶里，容量瓶量程選取為100 mL，向容量瓶中添加甲醇，室溫避光放置，分別于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，將掃描波長(zhǎng)控制在345 nm，測(cè)定此時(shí)的吸光度。測(cè)定結(jié)果如下，溶液吸光度大體上沒(méi)有改變，這說(shuō)明供試品具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取已配好濃度為0.04 mg·mL-1的鹽酸小檗堿標(biāo)品溶液4 mL，放于容量瓶中，容量瓶量程為10 mL，向容量瓶中添加甲醇溶液，直到溶液達(dá)到刻度線，將掃描波長(zhǎng)控制在345 nm，測(cè)定此時(shí)溶液的吸光度。結(jié)果見(jiàn)表3，吸光度值基本無(wú)變化，說(shuō)明儀器具有良好的精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考價(jià)值較高。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)

2.2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 精密稱量黃連粉末10 g 5份，以75%的乙醇為提取溶劑，提取3 h后取提取液，吸取提取液0.1 mL，分別放于五個(gè)容量瓶中，容量瓶量程均為100 mL，向容量瓶中添加甲醇溶液，直到溶液達(dá)到刻度線，將添加過(guò)甲醇溶液的容量瓶試劑作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照，掃描波長(zhǎng)控制在345 nm，測(cè)定此時(shí)溶液的吸光度，結(jié)果見(jiàn)表4，吸光度值無(wú)變化，表明此法重現(xiàn)性良好。

2.2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取供試品75%乙醇3h提取液0.1mL，置于100 mL容量瓶中，分別加入濃度為0.04 mg·mL-1的鹽酸小檗堿標(biāo)品溶液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL，添加甲醇溶液，直到平視時(shí)溶液達(dá)到刻度線位置，將量取的甲醇溶液作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照溶液，將掃描波長(zhǎng)控制在345 nm，測(cè)定此時(shí)的吸光度，根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算出實(shí)驗(yàn)回收率。結(jié)果見(jiàn)表5，表明該方法準(zhǔn)確度高，可靠性強(qiáng)。

3 結(jié)果分析與討論

3.1 提取條件不同對(duì)鹽酸小檗堿在黃連成分中占比大小的影響結(jié)果

不同提取條件對(duì)黃連中鹽酸小檗堿含量的影響結(jié)果見(jiàn)表6和圖2。

由表6和圖2可以看出，75%的乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間為3h時(shí)，提取的鹽酸小檗堿含量最高，達(dá)12.42%。三種不同濃度的乙醇溶劑提取，小檗堿含量從高到低順序依次為75%乙醇﹥95%乙醇﹥無(wú)水乙醇；不同提取時(shí)間進(jìn)行提取，小檗堿含量從高到低順序依次為3h﹥2h﹥1h。

圖2提取條件不同對(duì)鹽酸小檗堿在黃連成分中占比的影響

3.2 分析與討論

3.2.1 黃連品種不同造成其含有的鹽酸小檗堿量的不同 根據(jù)前人[10,11]對(duì)不同品種黃連藥材的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連的細(xì)分種類不同，其含有的鹽酸小檗堿的量也不同，在已知的黃連中，云連中的鹽酸小檗堿含量排名第一，第二為雅連，鹽酸小檗堿含量最少的是味連，雖然云連中含量最高，但是云連的產(chǎn)量低，而味連的產(chǎn)量較高，因此在實(shí)驗(yàn)中選擇味連作為實(shí)驗(yàn)藥材。

3.2.2 選擇不同的提取溶劑給提取率帶來(lái)的影響 在溫度較高的純凈水或者溫度較高的乙醇溶液中，鹽酸小檗堿具有更高的溶解度，當(dāng)溫度降低其溶解度也隨之減少，在實(shí)驗(yàn)中，可以深入研究甲醇與乙醇的差別，選擇更合適的提取溶劑。甲醇具有毒性并且使用甲醇作為溶劑會(huì)增加成本投入，不僅保障不了安全性還會(huì)影響到其他實(shí)驗(yàn)用品的選取，因此實(shí)驗(yàn)的提取溶劑定為乙醇。

3.2.3 含量測(cè)定方法的選擇 鹽酸小檗堿的含量測(cè)定方法有多種[12]，采用紫外分光光度法相對(duì)于其他方法而言操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，結(jié)果可靠，將該方法用于測(cè)定鹽酸小檗堿在黃連中的占比，得出的結(jié)果具有較高參考價(jià)值。

4 結(jié)論

4.1 最佳提取條件的確定

提取條件為75%的乙醇溶液、提取時(shí)間為3h，鹽酸小檗堿含量最高，達(dá)12.42%，可作為黃連中小檗堿的最佳提取條件，亦為中藥黃連制劑生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4.2 含量測(cè)定方法

在實(shí)驗(yàn)中，提取鹽酸小檗堿的方法大多為乙醇回流法，因?yàn)樵摲椒ú襟E簡(jiǎn)單且提純率較高，通過(guò)紫外分光光度法在345 nm處測(cè)其吸光度值，能夠有效的計(jì)算出鹽酸小檗堿在黃連的所有成分中含量占比多少。此法簡(jiǎn)便實(shí)用，結(jié)果可靠，可以給醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開(kāi)發(fā)黃連資源提供助推力，值得推廣。