梔子UGT基因家族UGT86A1和UGT85A2基因克隆與表達(dá)模式分析

劉 倩，谷振軍，符 潮，2，楊春霞

（1.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330032；2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

梔子Gardenia jasminoides是茜草科Rubiaceae植物中的一種傳統(tǒng)中藥，具有鎮(zhèn)痛止血、護(hù)肝利膽、消炎消腫等作用，主要產(chǎn)自江西、湖南、四川、重慶等地，種植面積廣，產(chǎn)量高[1-2]。梔子果實(shí)中的活性成分之一西紅花苷是一種能夠抗氧化、炎癥以及腫瘤的脫輔基類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)化合物[3-4]，包括西紅花苷I、II、III、IV、V，主要成分為西紅花苷I，存在于鳶尾科Iridaceae植物番紅花Crocus sativus的柱頭和梔子果實(shí)中。由于番紅花柱頭產(chǎn)量極低且價(jià)格昂貴，而種植面積廣且產(chǎn)量高的梔子果實(shí)中的西紅花苷含量?jī)H次于番紅花柱頭，因此，梔子果實(shí)有望替代番紅花成為生產(chǎn)西紅花苷的主要來(lái)源。

近年來(lái)，梔子西紅花苷生物合成途徑中的關(guān)鍵基因的克隆與表達(dá)模式分析成為熱門(mén)研究，尤其梔子染色體水平基因組的破譯為西紅花苷合成生物學(xué)研究及梔子分子輔助育種等提供理論支撐。西紅花苷在生物體內(nèi)合成復(fù)雜，由多種酶共同催化生成。西紅花苷合成的骨架物質(zhì)為異戊二烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate,IPP），而IPP合成則來(lái)自質(zhì)體內(nèi)的甲基赤蘚糖磷酸MEP 途徑（Rodríguez-Concepción,2004），1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶 （DXS）是MEP 途徑中的限速酶[5-6]。目前在梔子中已發(fā)現(xiàn)一些參與西紅花苷合成的相關(guān)基因，并研究了乙烯反應(yīng)元件因子基因（ERF）、八氫番茄紅素合成酶基因（PSY）、八氫番茄紅素脫飽和酶基因（PDS）、類(lèi)胡蘿卜素剪切雙加氧酶基因（CCD4）等關(guān)鍵基因的克隆與表達(dá)分析[7-11]。

UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因（UGT）編碼一種葡萄糖醛酸化途徑的UDP 葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)將尿苷5′-二磷酸葡萄醛酸轉(zhuǎn)移至形成β-d 葡萄糖醛酸的有效底物上[12-13]，參與花色苷的生物合成以及調(diào)節(jié)有機(jī)體的生物活性[14-15]。在西紅花苷合成途徑中，糖基轉(zhuǎn)移酶催化最后一步的合成，即將非親水性西紅花酸催化生成水溶性的西紅花苷[16]。有研究表明在梔子果實(shí)中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT75L6 和UGT94E5 在西紅花苷合成中催化糖基化反應(yīng)[17-18]。最新研究完整解析了西紅花苷生物合成途徑中GjUGT74F8 和GjUGT94E13共同催化西紅花酸合成西紅花苷[19]，并在此基礎(chǔ)上將梔子來(lái)源的UGT 整合至大腸桿菌中高效合成西紅花苷[20]，但對(duì)該家族基因的克隆表達(dá)及分析卻鮮有報(bào)道。因此，本研究基于梔子轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果，在梔子中發(fā)現(xiàn)UGT家族基因87 個(gè)，主要包括GT1、GT3、UGT74F8、UGT94E5-1、UGT94E5-2、UGT709C2、UGT86A1和UGT85A2等基因，從中挑選出2 個(gè)差異表達(dá)的基因UGT86A1與UGT85A2進(jìn)行克隆，對(duì)其蛋白理化性質(zhì)、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、跨膜結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)以及不同物種中同源性對(duì)比進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行組織表達(dá)特異性分析和西紅花苷-1 含量測(cè)定，為闡明梔子中西紅花苷的合成調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

梔子葉、花、7月果（果皮綠色，果肉白色）、8月果（果皮綠色，果肉淺黃色）、9月果（果皮淺黃色，果肉橘色）以及11月果（果皮紅色，果肉橘紅色）均采自江西省共青城（29°11′24″N,115°46′48″E），所有材料75%酒精消毒后剪下立即放入液氮中速凍，-80℃保存。

1.2 試驗(yàn)試劑

RNA 提取試劑盒（0416-50 GK 型）購(gòu)自華越洋生物有限公司，大腸桿菌（trans5α）感受態(tài)（CD201）、pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit（CB501-01）載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR420A）、膠回收試劑盒（9762）以及熒光定量PCR試劑盒（RR036A）購(gòu)自TaKaRa 公司，西紅花苷I 對(duì)照品（B21337，純度≥98%)購(gòu)自西上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 UGT86A1 和UGT85A2 基因克隆

采用華越洋RNA 提取試劑盒提取梔子成熟果實(shí)的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA?；跅d子轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果，利用GENSCAN、Pfam 和SMART 得到候選的具有全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框（ORF）的UGT86A1與UGT85A2序列，利用Oligo 7 設(shè)計(jì)出UGT86A1、UGT85A2的ORF克隆引物（表1）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA 50 ng，Primer STAR Max DNA polymerase（2×）25 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加滅菌的Milli-Q 水補(bǔ)充至50 μL。PCR 的擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃3 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)回收純化后與pEASY?-Blunt Zero Cloning Vector 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（trans5α）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)繁，經(jīng)驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序分析。引物合成由金斯瑞生物科技有限公司完成，序列測(cè)定由TaKaRa 公司完成。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

利用在線工具ExPasy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析梔子UGT86A1 與UGT85A2 蛋白分子質(zhì)量、氨基酸組成以及等電點(diǎn)等蛋白理化性質(zhì)。運(yùn)用SignalP 5.0（ http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)UGT86A1 和UGT85A2 蛋白的信號(hào)肽，TMHMM Server v.2.0（ http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)，Cell-PLoc 2.0（ http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。使用在線軟件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)UGT86A1 和UGT85A2 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（ http://pfam.xfam.org/）預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)域。采用ClustalX 2.0 軟件對(duì)UGT86A1、UGT85A2 蛋白進(jìn)行多重序列對(duì)比，隨后用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析。空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用SWISS-PDB 在線軟件（https://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行分析。

1.3.3 UGT86A1 和UGT85A2 基因組序列測(cè)定

梔子果實(shí)DNA 按照CTAB 法進(jìn)行提取[21]，用ORF 框正反引物擴(kuò)增基因UGT86A1、UGT85A2在梔子基因組上的序列。擴(kuò)增正確的目的片段經(jīng)切膠回收、連接T 載體后，在大腸桿菌trans5α中轉(zhuǎn)化，PCR 菌液檢測(cè)陽(yáng)性菌落后送測(cè)。引物合成由金斯瑞生物科技有限公司完成，序列測(cè)定由TaKaRa 公司完成。

1.3.4 熒光定量PCR

分別以梔子的不同組織葉、花、7月果、8月果、9月果以及11月果的cDNA 為模板，對(duì)梔子UGT86A1、UGT85A2基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT PCR）檢測(cè)。用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)18S、UGT86A1和UGT85A2的熒光定量引物（表1）。qRT-PCR 使用TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒在CFX96 Real-Time PCR Detection System 儀器上進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)。反應(yīng)體系為：TB Green Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板2 μL，加滅菌的Milli-Q 水補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃30 s，40 個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后通過(guò)溶解曲線檢測(cè)引物的特異性。以18S基因作為內(nèi)參基因，運(yùn)用2-△△CT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 梔子克隆和熒光定量引物序列Table 1 Gardenia jasminoides cloning and fluorescent quantitative primer sequence

1.3.5 西紅花苷含量測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定梔子不同部位及不同發(fā)育階段果實(shí)的西紅花苷-I 含量。取梔子藥材粉末約0.35 g，精密稱(chēng)定，分別置100 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，超聲提取30 min，放冷，經(jīng)0.45 mm 微孔濾膜，濾液即為供試品溶液。色譜條件：島津LC-20AT HPLC，島津ODS 柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)：1%乙酸水(B)梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子UGT86A1、UGT85A2 基因克隆及序列分析

以UGT86A1、UGT85A2基因的ORF 框特異性引物，以梔子成熟果實(shí)cDNA 為模板，PCR擴(kuò)增分別獲得987、1 446 bp 的目的基因片段，推導(dǎo)其編碼的氨基酸數(shù)目分別為328 和481 個(gè)。UGT86A1 蛋白中含量最高的氨基酸為絲氨酸（Ser），占總氨基酸的9.8%，帶負(fù)電殘基總數(shù)，即天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）數(shù)量之和為39 個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)，即精氨酸（Arg）和賴(lài)氨酸（Lys）數(shù)量之和為30 個(gè)；而UGT85A2蛋白中含量最高的氨基酸為異亮氨酸，占總氨基酸的12.5%，帶負(fù)電殘基總數(shù)為60 個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)為43 個(gè)。通過(guò)分析預(yù)測(cè)UGT86A1 和UGT85A2 蛋白分子質(zhì)量（MW）分別約為36.6和53.5 kD，理論等電點(diǎn)（pI）分別為5.23 和5.06，脂溶指數(shù)（Aliphatic index）分別為99.48和91.23。UGT86A1 和UGT85A2 蛋白的原子組成均有C、H、N、O、S，UGT86A1 蛋白的原子總數(shù)是5 156，為C1648H2578N432O485S13；UGT85A2蛋白的原子總數(shù)是7 518，為C2411H3758N614O712S23。UGT86A1 不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為35.65，據(jù)此將該蛋白歸類(lèi)為穩(wěn)定蛋白；UGT85A2 蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為45.22，據(jù)此將該蛋白歸類(lèi)為不穩(wěn)定蛋白。UGT86A1 和UGT85A2 蛋白總平均親水性（GRAVY）分別為0.047 和-0.130，預(yù)測(cè)UGT86A1 蛋白為疏水性蛋白，UGT85A2 蛋白為親水性蛋白。

SignalP 5.0 預(yù)測(cè)梔子UGT85A2 蛋白無(wú)信號(hào)肽，UGT86A1 氨基酸序列的N 端具有信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，切割位點(diǎn)位于18 和19 位氨基酸之間（圖1）。TMHMM Server v.2.0 預(yù)測(cè)UGT86A1 與UGT85A2 均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。根據(jù)Cell-PLoc 2.0 預(yù)測(cè)顯示，UGT86A1 與UGT85A2 蛋白均為葉綠體蛋白。使用SOPMA 在線軟件預(yù)測(cè)UDPG14 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示UGT86A1與UGT85A2α 螺旋（Alpha helix）結(jié)構(gòu)分別占41.77%和43.04%，延伸鏈（Extended strand）結(jié)構(gòu)分別占13.11%和15.59%，β 轉(zhuǎn)角（Beta turn）結(jié)構(gòu)分別占7.01%和7.07%，無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）結(jié)構(gòu)分別占38.11%和34.30%。使用SWISS-PDB 在線軟件預(yù)測(cè)梔子UGT86A1、UGT85A2 蛋白空間結(jié)構(gòu)（圖2），UGT86A1 建模蛋白與模板序列相似度為32.52，而UGT85A2 建模蛋白與模板序列相似度為58.53，推測(cè)UGT85A2 蛋白同源建模更具參考意義。

圖1 UGT86A1 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of signal peptide of UGT86A1 protein

圖2 梔子UGT86A1、UGT85A2 蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of spatial structure of UGT86A1 and UGT85A2 proteins in Gardenia jasminoides

2.2 UGT86A1、UGT85A2 序列對(duì)比及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)BlastP 檢索發(fā)現(xiàn)，梔子UGT86A1 蛋白與同為茜草科的中?？Х菴offea canephora（CDP18343.1）、小粒咖啡Coffea arabica（XP_027107200.1）序列相似度高達(dá)92%～93%，與同源UGT75L6 和UGT74F8 序列相似性在85%左右，與不同科屬的藍(lán)果樹(shù)Nyssa sinensis（KAA8518730.1）、林煙草Nicotiana sylvestris（XP_009802698.1）、野生煙草Nicotiana attenuata（XP_019250687.1）、絨毛狀煙草Nicotiana tomentosiformis（XP_009610181.1） 的序列相似度也在75%以上，與同源UGT94E13相似度為74%； 梔子UGT85A2 蛋白與同源UGT75L6、UGT74F8 序列相似度高達(dá)97%，與UGT94E13、UGT94E5 序列相似度為92%，與茜草科的歐基尼奧伊德斯種咖啡Coffea eugenioides（XP_027149647）、小?？Х菴offea arabica（XP_027094782.1）、中?？Х菴offea canephora（CDP01076.1）的相似度高達(dá)90%以上，與茄科的寧夏枸杞Lycium barbarum（BAG80542.1）、野生煙草Nicotiana attenuata（XP_019225689.1）、夾竹桃科的長(zhǎng)春花Catharanthus roseus（F8WLS6.1）等物種相似度也在74%以上。采用ClustalX 2.0 軟件對(duì)這些物種的氨基酸序列進(jìn)行多重序列對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)UGT86A1 蛋白在91～286 位氨基酸區(qū)域和UGT85A2 蛋白在207～448 位氨基酸區(qū)域均存在一個(gè)保守UDPGT 結(jié)構(gòu)域，且UDPGT 蛋白在這些物種中高度保守（圖3）。

圖3 梔子UGT86A1 和UGT85A2 蛋白的氨基酸序列分析Fig.3 Amino acid sequence analysis of UGT86A1 and UGT85A2 protein from Gardenia jasminoides

續(xù)圖3Continuation of Fig.3

利用MEGA 7.0 軟件的鄰接法（Neighbor joining，NJ）對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（圖4），發(fā)現(xiàn)這些植物的UDPGT 蛋白具有共同的進(jìn)化源，由兩個(gè)大的進(jìn)化枝組成，UGT94E13和UGT94E5 組成第一個(gè)進(jìn)化枝。第二個(gè)大進(jìn)化枝由兩個(gè)小分支構(gòu)成，UGT75L6 和UGT74F8 構(gòu)成一個(gè)小分支，在另一個(gè)小分支中，梔子UGT86A1蛋白與中粒咖啡、小粒咖啡、藍(lán)果樹(shù)、林煙草、野生煙草、絨毛狀煙草屬于同一分支，梔子UGT85A2 蛋白與歐基尼奧伊德斯種咖啡、小?？Х取⒅辛？Х取幭蔫坭?、野生煙草和長(zhǎng)春花屬于另一分支。在親緣關(guān)系上，梔子UGT86A1 蛋白與中?？Х?、小?？Х汝P(guān)系最近；UGT85A2 蛋白也與同屬茜草科的歐基尼奧伊德斯種咖啡、小粒咖啡以及中?？Х汝P(guān)系最近。

圖4 UDPGT 在不同物種中的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of UDPGT in different species

2.3 UGT86A1、UGT85A2 基因結(jié)構(gòu)分析

以梔子成熟果實(shí)DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增分別獲得987 和1 657 bp 的目的基因片段。通過(guò)將UGT86A1、UGT85A2ORF 框cDNA 序列與基因組序列進(jìn)行Blast 序列對(duì)比，顯示UGT86A1基因不含內(nèi)含子（圖5A），而UGT85A2基因含有兩個(gè)外顯子一個(gè)內(nèi)含子（圖5B）。

2.4 UGT86A1、UGT85A2 基因的qRT-PCR 表達(dá)分析

運(yùn)用qRT-PCR 技術(shù)對(duì)UGT86A1與UGT85A2基因在梔子不同部位及不同發(fā)育階段果實(shí)的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析（圖6）。結(jié)果表明：UGT86A1與UGT85A2在梔子葉和花中均有表達(dá)，且在葉中表達(dá)量較高；UGT86A1在梔子發(fā)育的不同階段大致呈現(xiàn)遞減式表達(dá)，即UGT86A1基因的表達(dá)量隨著梔子果實(shí)不斷發(fā)育成熟而降低，而UGT85A2在梔子果實(shí)不同發(fā)育階段則呈遞增式表達(dá)，即梔子果實(shí)的UGT85A2表達(dá)量隨著果實(shí)的不斷成熟而增加，并且11月果的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他階段果實(shí)的表達(dá)量。

圖6 梔子不同發(fā)育階段的UGT86A1 和UGT85A2 表達(dá)量Fig.6 Expression of UGT86A1 and UGT85A2 in Gardenia jasminoides at different developmental stages

2.5 UGT86A1、UGT85A2 基因表達(dá)量與西紅花苷I 含量的相關(guān)性分析

運(yùn)用HPLC 法對(duì)梔子中不同部位及不同發(fā)育階段果實(shí)的西紅花苷Ⅰ含量進(jìn)行分析測(cè)定（圖7A），并運(yùn)用SPSS 分別對(duì)西紅花苷含量與UGT86A1和UGT85A2表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析（圖7B）。結(jié)果表明，在梔子葉和花中檢測(cè)不到西紅花苷Ⅰ，而在梔子不同發(fā)育階段中西紅花苷含量則隨著果實(shí)不斷發(fā)育成熟而增加，在采摘期（11月初）含量達(dá)到最高。相關(guān)性結(jié)果分析表明梔子果實(shí)中西紅花苷含量的增加趨勢(shì)與UGT85A2基因表達(dá)呈現(xiàn)不顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.128），表明UGT85A2對(duì)西紅花苷合成可能具有促進(jìn)作用，但不關(guān)鍵，提示下一步應(yīng)該從候選基因中進(jìn)一步篩選關(guān)鍵正調(diào)控基因。西紅花苷含量與UGT86A1基因的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為-0.69），表明UGT86A1對(duì)西紅花苷合成可能具有負(fù)調(diào)控作用，下一步將通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行功能驗(yàn)證。

圖7 UGT86A1、UGT85A2 基因表達(dá)與西紅花苷含量的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of UGT86A1,UGT85A2 gene expression and crocin content

3 結(jié)論與討論

西紅花苷是梔子的有效活性成分之一，其含量的差異性是衡量梔子是否能夠作為地道中藥材的關(guān)鍵性評(píng)價(jià)指標(biāo)。西紅花苷合成關(guān)鍵基因及通路的研究是梔子進(jìn)一步深入研究的關(guān)注點(diǎn)。眾多相關(guān)研究認(rèn)為UGT基因家族是控制梔子西紅花苷合成的重要基因家族之一。因此，本研究對(duì)UGT基因家族中UGT86A1與UGT85A2的克隆表達(dá)模式進(jìn)行分析，并對(duì)其所控制合成的蛋白結(jié)構(gòu)及親源性關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明UGT86A1與UGT85A2基因編碼的蛋白均與同為茜草科植物的中?？Х?、小?？Х扔H緣關(guān)系最近，這一點(diǎn)基本與茜草科植物遺傳背景與進(jìn)化關(guān)系保持一致。

其次，UGT是膜結(jié)合酶超家族，其糖基化調(diào)控機(jī)制在植物激素平衡、脅迫防御反應(yīng)及次生代謝產(chǎn)物修飾等方面發(fā)揮重要作用[13]。大部分的植物激素及植物花果中類(lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素等物質(zhì)的合成與積累均需要糖基轉(zhuǎn)移酶的參與[22]。如最常見(jiàn)的類(lèi)黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT)能夠催化葡萄糖糖基化取代花色素3-OH 基團(tuán)，使花色素合成為各種花色苷[13]；也有相關(guān)研究表明UGT73B6，UGT72B14等UGT基因家族通過(guò)控制合成尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，在紅景天苷合成途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。UGT基因的表達(dá)存在正負(fù)調(diào)控作用，相關(guān)研究表明，sgUDPG1基因?qū)α_漢果甜苷的合成具有正調(diào)控作用[24]，海蓀鳶尾在鎘脅迫下部分UGT基因會(huì)出現(xiàn)負(fù)調(diào)控作用[13]。西紅花苷作為植物次生代謝物中的一種類(lèi)胡蘿卜素，其合成積累同樣需要糖基轉(zhuǎn)移酶的參與。Dufresne 等[25]與Cote 等[26]研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)番紅花中兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶GTase1 和GTase2 能夠催化西紅花酸生成西紅花苷。梔子基因組完整解析了GjUGT74F8 和GjUGT94E13 共同催化西紅花酸合成西紅花苷[19]，進(jìn)一步證實(shí)了UGT基因家族在西紅花苷合成途徑中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

梔子基因組的破譯為梔子西紅花苷合成關(guān)鍵基因的挖掘與合成通路的研究提供了基礎(chǔ)，但UGT基因家族中眾多基因的作用與西紅花苷合成的關(guān)聯(lián)性亟需進(jìn)一步分析驗(yàn)證。相關(guān)研究表明，在梔子果實(shí)中有兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75L6 和UGT94E5 在西紅花苷合成中催化糖基化反應(yīng)，但結(jié)果表明其基因的表達(dá)與西紅花苷積累并無(wú)相關(guān)性[17-18]。而本研究結(jié)果表明梔子UGT85A2 的表達(dá)西紅花苷含量積累無(wú)顯著相關(guān)，而UGT86A1 的表達(dá)與梔子果實(shí)中西紅花苷的積累具有顯著負(fù)相關(guān)性。因此，推測(cè)UGT86A1在梔子西紅花苷合成中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。這一點(diǎn)為解析UGT基因家族參與調(diào)控西紅花苷合成的相關(guān)研究提供了新的思路與證據(jù)。由于梔子本體遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建具有局限性，下一步將研究這兩個(gè)基因在煙草、擬南芥中的遺傳表達(dá)及其亞細(xì)胞定位分析等，最終闡明其在梔子中的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制。