防己黃芪湯對(duì)小鼠抗炎鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制研究

覃清霞 何歡 梁艷媚 唐巨英 戴傳勇

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530007）

防己黃芪湯出自《金匱要略》：“風(fēng)濕脈浮身重，汗出惡風(fēng)者，防己黃芪湯主之”，由防己、黃芪、甘草、白術(shù)組成，常加以姜、棗調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，具有祛風(fēng)除濕、益氣固表之功效?，F(xiàn)在防己黃芪湯加減法被運(yùn)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、原發(fā)性腎小球腎炎等炎性疾病的臨床治療中[1-3]。而目前對(duì)于防己黃芪湯抗炎鎮(zhèn)痛藥理作用及其作用機(jī)制研究甚少，因此本研究通過建立動(dòng)物炎癥及疼痛模型，觀察防己黃芪湯對(duì)小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛作用，并初步探討其可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為NO.43004700059138。動(dòng)物按性別分籠飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，室溫（22±2）℃，濕度（60±5）%，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

防己、黃芪、甘草、白術(shù)均購(gòu)自華泰中藥飲片有限責(zé)任公司；生理鹽水，貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)D19042704；阿司匹林，江蘇平光制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)190301；地塞米松，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)200132；伊文思藍(lán)，sigma公司，批號(hào)E2129；二甲苯，天津富寧精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20200305；N-1-萘乙二胺鹽酸溶液，廣州檢測(cè)科技有限公司，批號(hào)ZCD98；SOD試劑盒，Solarbio公司，批號(hào)BC0170；冰醋酸，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，批號(hào)20191001；對(duì)氨基苯磺酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20200628；氫氧化鉀，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心，批號(hào)20170214；磷酸，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，批號(hào)20200601；電子天平，昆山優(yōu)科維特電子科技有限公司，型號(hào)LQ-C5001；分析天平，蘇州培科實(shí)驗(yàn)室儀器科技有限公司，型號(hào)AS220-R2；電熱板，北京萊伯泰科技儀器股份有限公司，型號(hào)EH-20A；離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)TD5A-WS型；紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司制造，型號(hào)752N型。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 防己黃芪湯制備

防己黃芪湯由防己12g、黃芪15g、甘草6g、白術(shù)9g組成。取上述6劑中藥，常規(guī)方法水煎煮，煎液濃縮至126mL，得2g/mL防己黃芪湯水煎劑，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。小鼠用藥劑量按小鼠?0g）與人（70kg）服用中藥量進(jìn)行換算，小鼠所用劑量為6.4g/kg，后續(xù)試驗(yàn)均按此藥量進(jìn)行。

2.2 抗炎實(shí)驗(yàn)

2.2.1 防己黃芪湯對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響取昆明小鼠30只隨機(jī)分為5組，分別為防己黃芪湯高劑量組（12.8g/kg）、中劑量組（6.4 g/kg）、低劑量組（3.2g/kg）、地塞米松組（0.025g/kg）及空白對(duì)照組。防己黃芪湯各組灌胃給藥，每天一次，連續(xù)7d，空白對(duì)照組給予相應(yīng)體積的生理鹽水。地塞米松組于第4d開始灌胃給藥，每天一次，連續(xù)4d。末次給藥后1h，在小鼠右耳正反面涂抹0.05mL二甲苯致炎，左耳耳廓不涂作為對(duì)照，40min后，摘眼球取血，分離血清備用。脫頸椎處死小鼠，使用直徑為8mm的打孔器在小鼠左右耳相同部位取下耳片并稱重，以左右耳片重量差值表示腫脹度，并計(jì)算腫脹抑制率。

腫脹度=右耳片重量－左耳片重量

抑制率=（空白對(duì)照組耳腫脹度-給藥組耳腫脹度）/空白對(duì)照組耳腫脹度×100%

2.2.2 防己黃芪湯對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 動(dòng)物分組及給藥同2.2.1。末次給藥后1h，各組小鼠按體重0.1mL/10g的量尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液，隨即腹腔注射0.6%醋酸溶液。20min后脫頸椎處死小鼠，打開腹腔，使用4mL生理鹽水分3次洗滌腹腔，將洗滌液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中并用生理鹽水定容至10mL，3000r/min離心10min，取上清液，于590nm處檢測(cè)吸光度A值，計(jì)算炎癥抑制率。

炎癥抑制率（%）=（空白對(duì)照組吸光度-給藥組吸光度）/空白對(duì)照組吸光度×100%。

2.3 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

2.3.1 防己黃芪湯對(duì)小鼠熱板痛閾值的影響 將熱板儀溫度設(shè)定為55℃，取健康雌性小鼠放入熱板中，5～30s內(nèi)舔足者納入實(shí)驗(yàn)。取符合標(biāo)準(zhǔn)的雌性小鼠30只，隨機(jī)分為5組，分別為防己黃芪湯高劑量組（12.8g/kg）、中劑量組（6.4g/kg）、低劑量組（3.2g/kg）、阿司匹林組（0.025g/kg）及空白對(duì)照組。每組給藥前重復(fù)測(cè)定痛閾值2次，取平均值作為正常痛閾值。各組灌胃給藥，每天一次，連續(xù)7d，空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水。末次給藥后30min、60min、120min分別測(cè)定各組小鼠痛閾值2次，取平均值作為痛閾值。如60s內(nèi)無反應(yīng)的小鼠，立即取出，防止?fàn)C傷，痛閾值按60s計(jì)算。

2.3.2 防己黃芪湯對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響 取昆明小鼠30只隨機(jī)平均分為5組，動(dòng)物給藥同2.3.1。末次給藥后1h，各組小鼠按0.1mL/10g腹腔注射0.6%醋酸溶液，記錄小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的潛伏期以及15min內(nèi)扭體次數(shù)，計(jì)算扭體反應(yīng)鎮(zhèn)痛率。

鎮(zhèn)痛率=（空白對(duì)照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/空白對(duì)照組扭體次數(shù)×100%

2.4 防己黃芪湯對(duì)小鼠臟器重量系數(shù)的影響

耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死小鼠，打開腹腔，觀察各組小鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器情況并稱重，計(jì)算臟器重量系數(shù)。

臟器重量系數(shù)（%）=臟器重量/體重×100%

2.5 防己黃芪湯對(duì)小鼠血清中PGE2、NO、SOD含量的影響

2.5.1 紫外分光光度法檢測(cè)小鼠血清中PGE2含量取0.2mL小鼠血清，加入0.5mol/L氫氧化鉀甲醇溶液1mL，混合均勻，置于50℃水浴20min，取出稍冷卻后2000r/min離心3min，取上清液，在278nm處測(cè)定吸光度A值，以A值表示PGE2含量。

2.5.2 Griess法檢測(cè)小鼠血清中NO含量 配制10mmol/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液、試劑A（取85%濃磷酸6mL、去離子水70mL及無水對(duì)氨基苯磺酸1g混合均勻，定容至100mL）、試劑B（0.1%N-1-萘乙二胺鹽酸溶液）。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液按濃度梯度進(jìn)行稀釋，分別加入試劑A與試劑B，在540nm處檢測(cè)吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本吸光度值及直線回歸方程計(jì)算樣品中NO濃度。

2.5.3 硫代巴比妥酸（TBA）法檢測(cè)小鼠血清中SOD活性 根據(jù)試劑盒說明書方法，測(cè)定小鼠血清中SOD活性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)

以±S表示，利用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 防己黃芪湯對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

防己黃芪湯對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響如表1所示，與空白對(duì)照組比較，地塞米松可明顯降低二甲苯所致小鼠耳腫脹度（P<0.01），其腫脹抑制率為57.02%，防己黃芪湯低、中、高劑量亦可明顯降低小鼠耳腫脹度（P<0.05，P<0.01），抑制率分別為26.91%、35.09%、48.84%。

表1 防己黃芪湯對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（x±S，n=6）

3.2 防己黃芪湯對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

防己黃芪湯對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響如表2所示，與空白對(duì)照組比較，地塞米松可明顯降低醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增加（P<0.01），防己黃芪湯低、中、高劑量亦可降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性，并呈劑量依賴性（P<0.05，P<0.01）。

表2 防己黃芪湯對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響（x±S，n=6）

3.3 防己黃芪湯對(duì)小鼠熱板痛閾值的影響

防己黃芪湯對(duì)小鼠熱板痛閾值的影響如表3所示，與空白對(duì)照組比較，在末次給藥后30min，防己黃芪湯高劑量可明顯提高小鼠痛閾值（P<0.05），而低、中劑量及阿司匹林并無明顯作用，末次給藥后60min，防己黃芪湯各劑量及阿司匹林均可顯著提高小鼠痛閾值（P<0.05，P<0.01），末次給藥后120min，阿司匹林及防己黃芪湯中、高劑量可提高小鼠痛閾值，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05，P<0.01）。與給藥前比較，阿司匹林在末次給藥后60min、120min均可提高小鼠痛閾值（P<0.01），防己黃芪湯低劑量?jī)H在給藥后60min可明顯提高痛閾值（P<0.01），而中劑量在給藥后60min、120min可顯著提高痛閾值（P<0.05，P<0.01），高劑量在末次給藥后30min、60min、120min均可顯著提高小鼠痛閾值（P<0.05，P<0.01）。

表3 防己黃芪湯對(duì)小鼠熱板痛閾值的影響（x±S，n=6）

3.4 防己黃芪湯對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響

防己黃芪湯對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響如表4所示，與空白對(duì)照組比較，阿司匹林可明顯延長(zhǎng)醋酸致扭體反應(yīng)潛伏期，減少扭體次數(shù)（P<0.01），鎮(zhèn)痛率為50.49%。防己黃芪湯各劑量均可延長(zhǎng)小鼠扭體潛伏期（P<0.05，P<0.01），中劑量與高劑量明顯減少小鼠扭體次數(shù)（P<0.01），鎮(zhèn)痛率分別為42.02%、36.82%，而低劑量有減少小鼠扭體次數(shù)的趨勢(shì)，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表4 防己黃芪湯對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響（x±S，n=6）

3.5 防己黃芪湯對(duì)小鼠臟器重量系數(shù)的影響

防己黃芪湯對(duì)小鼠臟器重量系數(shù)的影響如表5所示，與空白對(duì)照組比較，在給藥期間，0.025g/kg地塞米松、防己黃芪湯低劑量與中劑量對(duì)小鼠心、肝、脾、肺、腎臟器重量系數(shù)無明顯影響，防己黃芪湯高劑量對(duì)小鼠心、肝、肺、腎臟器重量系數(shù)亦無明顯影響，但明顯提高小鼠脾臟器重量系數(shù)（P<0.05）。

表5 防己黃芪湯對(duì)小鼠臟器重量系數(shù)的影響（x±S，n=6）

3.6 防己黃芪湯對(duì)小鼠血清中PGE2、NO含量及SOD活性的影響

防己黃芪湯對(duì)小鼠血清中PGE2、NO含量及SOD活性的影響如表6所示，與空白對(duì)照組比較，地塞米松可顯著降低血清中PGE2和NO含量、提高SOD活性（P<0.01），防己黃芪湯中、高劑量也明顯降低PGE2和NO含量、提高SOD活性（P<0.05，P<0.01），而低劑量有降低PGE2和NO含量、提高SOD活性的趨勢(shì)，但不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 防己黃芪湯對(duì)小鼠血清中PGE2、NO含量及SOD活性的影響（x±S，n=6）

4 結(jié)論與討論

防己黃芪湯出自《金匱要略》，防己祛風(fēng)濕止痛，黃芪益氣固表，兩藥合用可祛風(fēng)除濕、清熱止痛、利水消腫，白術(shù)補(bǔ)氣健脾祛濕，同時(shí)又增強(qiáng)防己與黃芪的功效，再以姜棗調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，益氣祛風(fēng)，健脾利水。本研究通過二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加方法，觀察防己黃芪湯抗炎效果，通過熱板法及醋酸扭體法觀察鎮(zhèn)痛效果。研究發(fā)現(xiàn)防己黃芪湯可抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹，降低醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增加，提高熱板痛閾值，延長(zhǎng)扭體反應(yīng)潛伏期，減少扭體次數(shù)，提示防己黃芪湯對(duì)炎癥及疼痛具有一定抑制作用。

炎癥是機(jī)體對(duì)生物、化學(xué)或物理等作用產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是多種生理病理過程的基礎(chǔ)，炎癥過程中往往伴隨著疼痛，而在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥介質(zhì)如PGE2、NO等起重要作用。[4-6]前列腺素是動(dòng)物體內(nèi)重要的脂質(zhì)介質(zhì)，由脂肪酸花生四烯酸經(jīng)酶促代謝合成，而PGE2是各種組織中檢測(cè)到最多的前列腺素，參與多種生理病理過程，如發(fā)熱、疼痛及炎癥等，加劇炎性疾病的發(fā)展。[7,8]NO具有針對(duì)致病性微生物的細(xì)胞毒性特性，同時(shí)也具有對(duì)宿主組織的破壞作用，是炎癥反應(yīng)的介質(zhì)及調(diào)節(jié)因子，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進(jìn)破壞，這些反應(yīng)包括舒張血管、增加血管通透性等，另外NO也參與疼痛的發(fā)展過程，有研究發(fā)現(xiàn)局部注射NO會(huì)產(chǎn)生疼痛，提示NO可能激活周圍痛覺感受器。[9-11]SOD是需氧生物體內(nèi)的通用酶，可催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧和過氧化氫，平衡體內(nèi)自由基水平，從而限制這些自由基的潛在毒性，因此SOD的活性常被用來反映體內(nèi)自由基水平。[12]本研究發(fā)現(xiàn)防己黃芪湯可降低炎癥模型小鼠血清中的PGE2、NO含量，提高SOD活性，提示防己黃芪湯抗炎鎮(zhèn)痛作用可能與抑制炎癥介質(zhì)PGE2和NO的生成、提高SOD活力有關(guān)。

綜上所述，防己黃芪湯具有明顯抗炎鎮(zhèn)痛作用，作用機(jī)制可能與減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)，更全面的機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。