點(diǎn)陣CO₂激光作用小鼠皮膚光老化模型后創(chuàng)面愈合過程中皮膚超微結(jié)構(gòu)的變化

丁衛(wèi)　譚軍　李高峰　歐陽華偉　秦曉東

[摘要]目的：觀察點(diǎn)陣CO2激光作用小鼠皮膚光老化模型后創(chuàng)面愈合過程表皮的超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。方法：將5只昆明小鼠以UVB紫外線照射，制備成皮膚光老化模型，行點(diǎn)陣CO2激光（Deep FX）干預(yù)，觀察激光創(chuàng)面愈合情況，并且分別于干預(yù)前、干預(yù)后第1、3、7、15天取材，進(jìn)行HE染色和電鏡觀察。結(jié)果：點(diǎn)陣CO2激光作用于小鼠皮膚光老化模型后，術(shù)后第1天，見激光損傷灶周圍變性組織及細(xì)胞水腫，成纖維細(xì)胞線粒體體積增大；術(shù)后第3天見表皮細(xì)胞向創(chuàng)底遷移，成纖維細(xì)胞出現(xiàn)增生，細(xì)胞內(nèi)線粒體增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，膠原纖維見周期性橫紋；術(shù)后第7天激光損傷灶創(chuàng)底見表皮細(xì)胞增殖，創(chuàng)面基本愈合，成纖維細(xì)胞增生活躍，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯、膠原纖維增多增粗；術(shù)后第15天，成纖維細(xì)胞趨于穩(wěn)定，膠原纖維排列密集。結(jié)論：點(diǎn)陣CO2激光通過對(duì)表皮的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生影響，達(dá)到對(duì)光老化皮膚良好療效。

[關(guān)鍵詞]光老化；點(diǎn)陣CO2激光；超微結(jié)構(gòu)

[中圖分類號(hào)]R730.57[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）10-0-0

光老化是人體暴露部位皮膚衰老的主要原因，隨著生活水平的提高，皮膚衰老的防治已經(jīng)成為人們生活的重要部分。目前點(diǎn)陣CO2激光治療皮膚光老化具有良好的療效，在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，點(diǎn)陣CO2激光作用于光老化皮膚后，皮膚修復(fù)過程中其超微結(jié)構(gòu)發(fā)生的病理變化以及這些變化的意義值得研究。本研究采用UVB照射小鼠背部皮膚，制造皮膚光老化模型，點(diǎn)陣CO2激光干預(yù)后，取材連續(xù)電鏡觀察創(chuàng)面愈合過程中皮膚超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1 主要儀器： LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)（瑞士）H-7500型透視電鏡（日本）。

1.2 動(dòng)物模型制備及實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1 動(dòng)物：清潔級(jí)昆明種小白鼠5只，體重20～25g，雌雄不限。

1.2.2 小鼠皮膚光老化模型制備：剪除小鼠背部5cm×10cm區(qū)域的毛，用15W＼UVB紫外燈置于小鼠背部裸露皮膚區(qū)正上方35cm處，每天照射2h，共照射50天，每天用電動(dòng)剃須刀剔除生長(zhǎng)出的小鼠毛，觀察小鼠皮膚變化，并拍照。

1.2.3 點(diǎn)陣激光干預(yù)：選用C02點(diǎn)陣激光（Deep FX，LUMENIS Ltd，美國），能量25～30 mJ，密度15%，單次掃描。創(chuàng)面予四環(huán)素眼膏外涂，一天3次。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大體觀察：每組小鼠取材時(shí)觀察激光干預(yù)后皮膚創(chuàng)面愈合情況。創(chuàng)面愈合以創(chuàng)面封閉且完全上皮化為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 組織學(xué)觀察：分別于干預(yù)前、干預(yù)后第1、3、7、15天取材，切取1cm×0.5cm皮膚組織標(biāo)本。組織標(biāo)本固定后，包埋，切片，行組織學(xué)觀察。 HE染色：觀察切片炎性細(xì)胞數(shù)量、膠原纖維排列、創(chuàng)面愈合變化情況。電鏡觀察： 表皮成纖維細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)及膠原纖維的變化規(guī)律。

2結(jié)果

2.1 小鼠皮膚光老化模型的鑒定：小鼠背部皮膚照射區(qū)出現(xiàn)皺紋、變厚變硬、色素沉著等改變。HE染色表皮厚度不均，角質(zhì)層增厚，表皮真皮連接境界清楚，膠原纖維排列紊亂。證明皮膚光老化動(dòng)物模型制備成功（圖1）。

2.2 大體觀察：治療過程中可見明顯的皮膚收縮，治療完后以四環(huán)素眼膏外涂，每日3次。術(shù)后第1天，小鼠背部創(chuàng)面稍有紅腫，無明顯滲出。術(shù)后第2天，可見部分創(chuàng)面結(jié)痂。術(shù)后第3天，創(chuàng)面結(jié)痂，紅腫基本消退，無滲出。術(shù)后第4天，創(chuàng)面痂皮出現(xiàn)脫落。術(shù)后第7天，創(chuàng)面痂皮基本脫落，可見少量毛發(fā)生長(zhǎng)。術(shù)后第15天，創(chuàng)面完全愈合，毛發(fā)生長(zhǎng)較快，皮膚色素及紋理較前減輕，創(chuàng)面無滲出等感染征象。

2.3 HE 染色：術(shù)后第1天，可見激光損傷灶周圍變性組織及周圍細(xì)胞水腫，真皮膠原纖維水腫（圖2）。術(shù)后第3天，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，真皮膠原纖維水腫表皮細(xì)胞向創(chuàng)底遷移（圖3）。術(shù)后第7天，激光損傷灶位置真皮層大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，變性膠原纖維處可見增生膠原纖維，損傷灶基底見表皮細(xì)胞增殖，損傷灶處表皮細(xì)胞呈多層分布（圖4）。術(shù)后15天，真皮膠原纖維排列有序，緊密，表皮組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)，毛囊有增生（圖5）。

2.3 電鏡觀察：電鏡下觀察皮膚成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及膠原纖維的變化， 結(jié)果顯示：光老化皮膚成纖維細(xì)胞線粒體腫脹膜性結(jié)構(gòu)模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯；膠原纖維分布不均勻，排列紊亂，周期性橫紋消失；橫斷面可見膠原纖維直徑大小不均（圖6）。激光治療術(shù)后第1天可見成纖維細(xì)胞線粒體體積增大，膠原纖維橫紋不清楚，變性膠原纖維呈高電子密度團(tuán)塊，間隙增大（圖7）；術(shù)后3天，成纖維細(xì)胞出現(xiàn)增生，線粒體體積增大，數(shù)量增多，膠原纖維見周期性橫紋（圖8）；術(shù)后第7天成纖維細(xì)胞增生活躍（圖9），線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富（圖10、11），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯；膠原纖維增多增粗；術(shù)后第15天，成纖維細(xì)胞趨于正常，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較前減少，膠原纖維排列密集新生的膠原纖維分布豐富，周期性橫紋清晰（圖12）。

3討論

光老化皮膚的主要組織學(xué)特征是皮膚基質(zhì)構(gòu)成的改變，即膠原蛋白成分的減少和異常彈性纖維蛋白沉積[1]。成纖維細(xì)胞是皮膚中最主要的細(xì)胞類型，細(xì)胞內(nèi)的線粒體能為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供場(chǎng)所，是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場(chǎng)所；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成分泌蛋白質(zhì)，，成纖維細(xì)胞各種生物學(xué)特性的改變是皮膚光老化形成的最重要基礎(chǔ)[2]。

紫外線照射皮膚可產(chǎn)生活性氧，降低皮膚成纖維細(xì)胞的活性及增殖能力，損傷線粒體[3]，膠原與彈性蛋白降解[4]，從而導(dǎo)致皮膚過早出現(xiàn)粗燥、皮溝加深、毛細(xì)血管擴(kuò)張、色斑等損害性癥狀，嚴(yán)重影響了人們的外表。隨著生活水平和審美標(biāo)準(zhǔn)的提高，人們對(duì)皮膚光老化的防治越來越重視。

在過去的20年中，超脈沖CO2激光換膚術(shù)被認(rèn)為是治療面部皮膚光老化的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]，2004年，Manstein等引入了激光嫩膚的新概念--點(diǎn)陣式光熱分解作用[6]。點(diǎn)陣CO2激光其獨(dú)特的作用形式--陣列樣排列的微小光束作用于皮膚，形成柱形結(jié)構(gòu)的微小熱損傷區(qū)，極大的減少了術(shù)后副作用的發(fā)生，被廣泛的應(yīng)用于臨床治療面部光老化[7-8]，但目前其對(duì)皮膚超微結(jié)構(gòu)的影響尚無相關(guān)報(bào)道。

筆者采用點(diǎn)陣CO2激光作用于小鼠光老化皮膚模型，觀察激光術(shù)后創(chuàng)面愈合過程中皮膚成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及膠原纖維的變化規(guī)律。結(jié)果表明，小鼠的光老化皮膚表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，膠原纖維膠分布不均勻，排列紊亂，周期性橫紋消失，橫斷面可見膠原纖維直徑大小不均；術(shù)后第1天成纖維細(xì)胞稀少，細(xì)胞內(nèi)線粒體體積增大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，膠原纖維橫紋不清楚，膠原纖維灶性鈣化壞死。術(shù)后第3天成纖維細(xì)胞出現(xiàn)增生，線粒體體積增大、數(shù)量增多，膠原纖維見周期性橫紋；術(shù)后第7天成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增多，胞體增大，具有三角形、梭行等多形性，胞質(zhì)內(nèi)充滿擴(kuò)張的大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體豐富，膠原纖維增粗增多；后第15天成纖維細(xì)胞形態(tài)基本正常，核仁明顯，膠原纖維排列緊密，新生的膠原纖維分布豐富，周期性橫紋清晰。在點(diǎn)陣CO2激光作用于光老化皮膚后創(chuàng)面的修復(fù)過程中，筆者先觀察到成纖維細(xì)胞的線粒體出現(xiàn)體積增大，以后出現(xiàn)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，成纖維細(xì)胞增生，新生的膠原纖維，可以認(rèn)為首先線粒體的功能增強(qiáng)，產(chǎn)生ATP的增多，為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成功能的增強(qiáng)，細(xì)胞的增殖提供動(dòng)力支持，而后粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，數(shù)量增多，合成與分泌蛋白能力的增強(qiáng)，為膠原纖維的新生，細(xì)胞的增殖提供物質(zhì)支持。在點(diǎn)陣CO2激光作用皮膚光老化后創(chuàng)面的修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞內(nèi)的線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)的改變發(fā)揮著重要的作用。

Pires Oliveira 等[9]用半導(dǎo)體激光的照射成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)照射后的24h、48h后核周區(qū)域出現(xiàn)了密集的線粒體。增殖72h后，線粒體形態(tài)呈絲狀到顆粒狀改變，線粒體分布于整個(gè)細(xì)胞漿內(nèi)，認(rèn)為低能量激光可以改變線粒體活性，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Paulo等[10]通過觀察低能量激光照射皮膚傷口愈合情況，發(fā)現(xiàn)低能量激光促進(jìn)傷口的愈合，增強(qiáng)了線粒體呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體Ⅱ（琥珀酸-Q還原酶）和Ⅳ（細(xì)胞色素氧化酶）的活性。筆者認(rèn)為在本研究中點(diǎn)陣CO2激光作用于光老化皮膚后，線粒體呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體Ⅱ（琥珀酸-Q還原酶）和Ⅳ（細(xì)胞色素氧化酶）的活性增強(qiáng)，線粒體內(nèi)膜的跨膜電位梯度和pH梯度的增加，致使質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)（即電化學(xué)梯度）增加，線粒體氧化還原狀態(tài)改變，加速了跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而加快的電子傳遞反應(yīng)，增加了ATP合成。線粒體氧化還原狀態(tài)及能量代謝的改變，引起一系列細(xì)胞效應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)。

點(diǎn)陣CO2激光治療皮膚光老化后皮膚自我修復(fù)過程中，引起成纖維細(xì)胞中超微結(jié)構(gòu)變化的分子調(diào)控機(jī)制，仍需要筆者的進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2012-06-29[修回日期]2012-08-14

編輯/張惠娟