植物乳桿菌KFY02發(fā)酵檸檬汁對高脂飲食小鼠肥胖的抑制作用及腸道菌群調節(jié)作用

張 靜，仇 偉，黃 月，趙 欣，楊 兵,

（1.重慶化工職業(yè)學院環(huán)境與質量檢測學院, 重慶 401228；2.山東省泰安英雄山中學, 山東泰安 271021；3.重慶第二師范學院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心, 重慶 400067）

肥胖是機體內脂肪大量堆積造成的一種身體不良狀態(tài)[1]。肥胖可造成機體內的包括代謝系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等生理系統(tǒng)異常，增加患心血管疾病和癌癥的風險[2-3]，還可能直接導致包括心臟病、糖尿病、脂肪肝等多種疾病[4-7]。肥胖還可能因為影響個體形象，造成肥胖者產生心理障礙[8]。肥胖人群多采用運動和控制飲食進行減肥，其中健康食品和科學的飲食都是有效減肥的手段。

檸檬是一種富含多種維生素、礦物質元素、檸檬酸和黃酮化合物的水果，其含有的有益物質具有包括抗氧化、抗衰老、提高免疫力、抗菌和預防心腦血管疾病等多種生物活性作用[9-14]。檸檬還具有良好的減肥效果，其中含有的檸檬酸能夠控制餐后出現(xiàn)的血糖值上升；還能夠促進機體產生乳酸，加快機體從食物獲取的糖質和脂質的轉化和消耗，防止能量在機體內的堆積[15]。另外，檸檬中含有的多種活性成分，能夠加速血液循環(huán)和代謝速度，加快能量的代謝和消耗，也起到減脂的作用[16]。

有研究顯示，有益微生物可以通過在腸道定殖起到改善腸道微生態(tài)的作用，從而減少食物進入腸道后的吸收時間，促使多余的脂肪和能量排出體外，減少機體吸收過量的能量物質，起到提升代謝率、控制體重的作用[17]。研究也顯示果蔬發(fā)酵汁能夠起到減肥作用[18]。但是現(xiàn)今國內的發(fā)酵飲品多采用進口發(fā)酵菌株，具有我國自主知識產權的優(yōu)質發(fā)酵菌種還較為缺乏，本研究使用從新疆地區(qū)自然發(fā)酵酸乳中分離出的一株具有自主知識產權乳酸菌對檸檬汁進行發(fā)酵，并觀察了發(fā)酵檸檬汁對高脂飼料致肥胖小鼠的減脂作用和腸道調節(jié)作用，初步探討了發(fā)酵檸檬汁對腸道的調節(jié)能力及其產生減脂作用的機制，以期為進一步開發(fā)發(fā)酵檸檬汁積累理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬 四川安岳黃檸檬；植物乳桿菌KFY02新疆庫爾勒維吾爾族牧民家庭自然發(fā)酵酸乳中分離鑒定出的植物乳桿菌，專利保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏號：CGMCC 15638）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、總蛋白（TP）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；PCR引物（表1）、Oligo（dT）18、RNase、dNT和 MLV 酶 美國賽默飛公司；C57BL/6小鼠 重慶恩思維爾生物科技有限公司，本研究中動物實驗經(jīng)重慶功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心倫理委員會批準（批準號：202103041B）。

表1 小鼠肝臟及糞便實驗使用的qPCR引物Table 1 qPCR primers used in mouse liver and feces experiment

Biomate3S分光光度儀、SepOne Plus定量PCR儀 美國賽默飛公司；正置光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司；白洋BY-160C離心機 北京白洋醫(yī)療器械有限公司；Bioprep-24生物樣品均質器 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檸檬汁發(fā)酵 取新鮮的檸檬1 kg，去皮后榨汁，過4層紗布過濾得鮮檸檬汁。在過濾得到的檸檬汁中按10%和0.15%（w/v）加入葡萄糖和植物乳桿菌KFY02菌粉，置于36 ℃下發(fā)酵12 h，發(fā)酵完成后置于4oC冰箱中待用。

1.2.2 動物實驗 50只6周齡雌雄各半的C57BL/6小鼠被置于恒溫（2±2oC）恒濕（50%±5%）和每 12 h輪換照明的房間中飼養(yǎng)，同時小鼠被隨機分為5組，分別為正常組、模型組、植物乳桿菌KFY02灌胃組、未發(fā)酵檸檬汁灌胃組和發(fā)酵檸檬汁灌胃組，每組10只小鼠。對除正常組外其余各組小鼠采用高脂飼料（表2）喂養(yǎng)，正常組小鼠采用正常飼料喂養(yǎng)，所有小鼠不限制飲水和飲食，持續(xù)喂養(yǎng)8周。在此過程中植物乳桿菌KFY02灌胃組小鼠每日按150 mg/kg（1.5×108CFU/kg） 灌胃量對小鼠實施灌胃植物乳桿菌KFY02，同時根據(jù)普通人群約每日60 mL純檸檬汁攝入量來確定小鼠灌胃量，即未發(fā)酵檸檬汁組小鼠每日按10 mL/kg灌胃量對小鼠實施灌胃未發(fā)酵檸檬汁，發(fā)酵檸檬汁組小鼠每日按10 mL/kg灌胃量對小鼠實施灌胃發(fā)酵檸檬汁，同樣持續(xù)8周，記錄小鼠體重。8周后對小鼠禁食不禁水24 h，然后對小鼠實施斷頸處死，心臟取血和取內臟及附睪脂肪組織進行相關測定并計算器官指數(shù)，器官指數(shù)=[器官質量（g）/小鼠體重（g）]×100[19]。

表2 實驗中小鼠飼料配料Table 2 List of feed ingredients for mice in the experiment

1.2.3 小鼠血清和肝臟指標測定 將取出的全血樣本在4oC下以4000 r/min的轉速離心10 min得到上層血清。同時精確稱量0.1 g肝組織，再在肝組織中加入0.9 mL生理鹽水進行勻漿。將勻漿后組織在4000 r/min的轉速離心10 min，收集上清液。采用ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C和 HDL-C檢測試劑盒測定血清和肝組織勻漿上清液小鼠血清和肝臟相關指標。

1.2.4 小鼠糞便中TC、TG和TP水平測定 小鼠禁食前收集各組小鼠的糞便，精確稱量0.1g糞便，再在糞便中加入0.9 mL生理鹽水進行勻漿。將勻漿后組織在4000 r/min的轉速離心10 min，收集上清液。采用TC、TG和TP檢測試劑盒測定糞便勻漿上清液相關指標。

1.2.5 小鼠肝臟和附睪脂肪組織病理學觀察 解剖后收集小鼠的肝組織和附睪脂肪組織在10%的福爾馬林中進行固定，在脫水48 h后，將組織樣品分別進行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（H&E）染色后通過光學顯微鏡觀察組織的病理學變化[20]。

1.2.6 小鼠肝組織中mRNA表達的測定 精確稱量1 g肝組織，在肝組織中加入9 mL生理鹽水進行勻漿，再加入1 mL的RNAzol提取小鼠肝組織中的RNA。使用超微分光光度法在260和280 nm處測定提取到RNA的吸光度值，計算RNA純度和濃度，將RNA濃度調整為1 μg/μL。然后通過反轉錄生成cDNA后，配制含1 μL cDNA的反應體系，其余試劑包括10 μL SYBR Green PCR Master Mix、7 μL無菌蒸餾水和上下游各1 μL引物溶液。在定量PCR儀中進行反應，反應條件為變性95 ℃持續(xù)60 s；95 ℃ 持續(xù) 15 s下進行 40個循環(huán)；退火 55 ℃持續(xù) 30 s；延伸 72 ℃ 持續(xù) 35 s；95 ℃ 持續(xù) 30 s；55 ℃持續(xù) 35 s。選擇β-actin 作為內參，并按 2-ΔΔCt法對其相關基因進行分析[20]。

1.2.7 小鼠糞便中微生物mRNA表達的測定 精確稱量1 g糞便，在糞便中加入9 mL生理鹽水進行勻漿。再按1.2.6方法測定小鼠糞便中微生物mRNA表達，從而檢測糞便中微生物的組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗進行三次平行測定，測定得到的結果以平均值表示，并計算出標準偏差，實驗結果表示為平均值±標準偏差。同時采用單因素方差分析計算各組數(shù)據(jù)之間是否具有顯著差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 實驗過程中小鼠的體重變化

由圖1可以看出，給予正常飼料的正常組小鼠體重在實驗的8周中表現(xiàn)出平穩(wěn)的體重增加，而給予高脂飼料的模型組小鼠體重大幅度增加，兩組小鼠之間的體重差異在8周后達到了9.28 g。由于植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬汁和發(fā)酵檸檬汁組小鼠給予高脂飼料，實驗過程中的體重均高于正常組，但是三組小鼠的體重也產生差異，發(fā)酵檸檬汁組小鼠高于正常組，低于植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬汁和模型組。體重較正常狀態(tài)大幅度增加是肥胖的重要表現(xiàn)，控制體重保持正常狀態(tài)是保持健康的重要手段[21]。本研究中在給予相同高脂飼料的條件下，發(fā)酵檸檬汁中不僅含有檸檬汁中的功效成分，還含有大量有益菌，因此能夠最大程度地減輕小鼠體重，效果明顯優(yōu)于植物乳桿菌KFY02和未發(fā)酵檸檬汁。

圖1 實驗過程中小鼠的體重情況Fig.1 Weight of mice during the experiment

2.2 小鼠器官指數(shù)

如表3所示，正常組小鼠的肝臟和附睪脂肪指數(shù)最低，而模型組小鼠的肝臟和附睪脂肪指數(shù)最高。相比模型組，植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬汁和發(fā)酵檸檬汁的肝臟和附睪脂肪指數(shù)均下降，其中發(fā)酵檸檬汁能夠最大程度地降低肝臟和附睪脂肪指數(shù)，這些指數(shù)顯著高于（P＜0.05）植物乳桿菌KFY02和未發(fā)酵檸檬汁組小鼠。機體體重增加后肝臟和體內的脂肪組織均會出現(xiàn)異常，有研究顯示肥胖小鼠的肝臟和附睪脂肪組織指數(shù)高于正常狀態(tài)[22]。本研究也得到了相同的結果，模型組由于誘導肥胖導致小鼠的肝臟和附睪脂肪組織指數(shù)高于正常組，發(fā)酵檸檬汁中含有的有效化合物和乳酸菌能夠緩解肥胖造成的組織器官指數(shù)異常，這 表明發(fā)酵檸檬汁是一種具有良好效果的功能性飲料。

表3 小鼠的肝臟指數(shù)和附睪脂肪指數(shù)Table 3 Liver index and epididymal fat index in mice

2.3 小鼠血清和肝臟的ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平

肝臟是脂肪代謝的重要器官，肥胖狀態(tài)下肝功能指標酶ALT、AST和AKP均會一定程度出現(xiàn)異常，所以ALT、AST和AKP均可作為肝功能的診斷酶[19]。同時，肥胖也對血脂產生異常，造成TC、TG、LDL-C水平異常上升，而HDL-C水平下降[23]。本研究中高脂飲食也造成肥胖小鼠（模型組）的ALT、AST、AKP、TG、TC、LDL-C水平異常上升，而HDLC水平異常下降（表4～表5）。正常組、發(fā)酵檸檬組、植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬組小鼠血清和肝組織的 ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C水平呈現(xiàn)出由低到高的趨勢，都顯著低于模型組（P＜0.05），而HDL-C水平呈現(xiàn)出由高到低的趨勢，且顯著高于模型組（P＜0.05）。

表4 小鼠血清ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平Table 4 Serum ALT, AST, AKP, TC, TG, LDL-C and HDL-C levels in mice

表5 小鼠肝臟ALT、AST、AKP、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平Table 5 Hepatic ALT, AST, AKP, TC, TG, LDL-C and HDL-C levels in mice

2.4 小鼠糞便的TC、TG和TP含量

由表6所示，正常組小鼠糞便中的TC、TG和TP含量顯著高于（P＜0.05）其余各組，模型組小鼠糞便的TC、TG和TP含量最低。植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬汁和發(fā)酵檸檬汁均能夠使肥胖小鼠糞便中的TC、TG和TP含量提高，且發(fā)酵檸檬汁提高糞便中TC、TG和TP含量的能力最強。TP、TC和TG大量聚集對機體的血脂和內臟，特別是肝臟都有較大影響[24]，研究顯示益生菌可以促進代謝過程中TC、TG和TP通過排泄排出體外，從而有效減輕機體的負擔，保護內臟，間接起到減脂的作用[18]。實驗結果顯示發(fā)酵檸檬汁能夠較多的促進排便排出TC、TG和TP，起到良好的減脂作用。

表6 小鼠糞便TC、TG和TP含量（mmol/g）Table 6 Contents of TC, TG and TP in mouse feces(mmol/g)

2.5 小鼠肝組織和附睪脂肪組織的組織變化

H&E染色切片顯示正常組小鼠肝組織細胞組織結構良好，肝小葉結構正常，細胞大小均勻，肝細胞邊界清晰，細胞核居中（圖2）。而模型組呈現(xiàn)出肝細胞變性，細胞邊界消失，中央靜脈形狀不規(guī)則、腫脹等狀態(tài)，且血管周圍有大量脂肪空泡。植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬汁和發(fā)酵檸檬汁均能起到緩解這些病理變化的作用，且發(fā)酵檸檬汁的效果最優(yōu)。

圖2 小鼠肝組織的H&E染色病理學切片觀察Fig.2 Observation on pathological sections of mouse liver tissue by H&E staining

同時，從圖3可以看出正常組小鼠附睪脂肪組織的脂肪細胞較小且排列整齊，而模型組小鼠附睪脂肪組織的脂肪細胞較大且聚集。植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬汁和發(fā)酵檸檬汁均能降低脂肪組織的體積，且發(fā)酵檸檬汁降低組織體積的作用強于植物乳桿菌KFY02和未發(fā)酵檸檬汁，能夠使脂肪組織形態(tài)接近于正常組。病理學觀察是直觀檢測組織損傷的手段[25]，本研究中植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬汁和發(fā)酵檸檬汁均能夠減輕肥胖造成的肝組織損傷和脂肪細胞堆積，發(fā)酵檸檬汁效果最好。

圖3 小鼠附睪脂肪組織的H&E染色病理學切片觀察Fig.3 Observation on pathological sections of mouse epididymal adipose tissue by H&E staining

2.6 小鼠肝組織 C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL和CYP7A1的mRNA表達

如圖4所示，正常組小鼠肝組織PPAR-α、CPT-1、LPL和CYP7A1的mRNA表達顯著強于（P＜0.05）其余各組，而C/EBPα和PPAR-γ的表達則顯著弱于（P＜0.05）其余各組。模型組小鼠肝組織的表達趨勢與正常組相反。相對模型組小鼠，植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬汁和發(fā)酵檸檬汁可以提升小鼠肝組織的 PPAR-α、CPT-1、LPL、CYP7A1的表達和降低 C/EBPα、PPAR-γ表達，發(fā)酵檸檬汁可以使C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL 和CYP7A1表達最為接近正常組小鼠。C/EBPα是生成脂肪和促進機體脂肪中高表達基因的關鍵轉錄因子，還能夠提升TC在機體中的水平[26]。PPAR是脂肪細胞分化的核轉錄因子，在與能量穩(wěn)態(tài)相關的組織中高度表達，能夠感知和解釋來自膳食脂質脂氧合酶或環(huán)氧合酶的脂肪酸信號。PPAR-α能夠控制脂肪堆積和能量的積累，PPAR-γ選擇性地上調對脂肪堆積和脂肪細胞大量產生的基因表達[27-28]。CPT1是一種參與TG分解代謝的關鍵酶，能夠有效地分解TG，促進機體內的脂代謝保持正常[29]。LPL是一種TG代謝的調節(jié)蛋白，可將富含TG的脂蛋白進行分解，從而有效的控制高脂肪的攝入[30]。而CYP7A1能夠調節(jié)TC和LDL-C水平，大量飲食脂質攝入后被激活，從而發(fā)揮減脂的作用[31]。研究顯示有益微生物可以有效調節(jié) C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL 和CYP7A1在機體中的表達[32]，同時，發(fā)酵過程也有可能產生新的化合物和代謝產物從而加強對這些表達的調控[33]，有利于減脂。由此可以看出，通過調控C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL 和CYP7A1表達能夠起到減脂作用，發(fā)酵檸檬汁中含有的乳酸菌及發(fā)酵產物能夠較好地調節(jié)這些表達，發(fā)揮其減脂減肥的作用，且強于單獨作用的檸檬汁或乳酸菌。

圖4 小鼠肝組織 C/EBPα、PPAR-α、PPAR-γ、CPT-1、LPL 和 CYP7A1 的 mRNA 表達Fig.4 mRNA expression of C/EBPα, PPAR-α, PPAR-γ, CPT-1, LPL and CYP7A1 in mouse liver tissue

2.7 小鼠糞便中厚壁菌門、擬桿菌門、乳酸桿菌和雙歧桿菌的mRNA表達

如圖5所示，正常組小鼠肝組織糞便中的厚壁菌門微生物的mRNA表達顯著低于（P＜0.05）其他各組，而擬桿菌門和雙歧桿菌的mRNA表達顯著高于（P＜0.05）其他各組。誘導肥胖后，模型組小鼠糞便中的厚壁菌門微生物的mRNA表達最高，而擬桿菌門、乳酸桿菌和雙歧桿菌的表達最低。植物乳桿菌KFY02、未發(fā)酵檸檬汁和發(fā)酵檸檬汁菌能夠使肥胖小鼠糞便中的厚壁菌門表達降低，使擬桿菌門和雙歧桿菌的表達增強，且發(fā)酵檸檬汁能夠使這些微生物的表達最為接近正常組。另外，正常組和植物乳桿菌KFY02組的乳酸桿菌表達無顯著差異（P＞0.05），高于未發(fā)酵檸檬組，而發(fā)酵檸檬組的乳酸桿菌表達最強。研究顯示腸道中的微生物群與腹部脂肪的堆積有直接關聯(lián)，健康的腸道微生物組成能夠減少脂肪的堆積，不僅能促進腸道健康，還能夠調節(jié)體脂和體重[31]。臨床研究也進一步證實腸道微生物群的組成比單純的飲食更能準確地預測腹部脂肪，是預判身體肥胖的新觀察點[34]。通過測定排便中的微生物表達，可以判斷出腸道菌群的情況[35]，本研究也采用定量PCR檢測小鼠糞便中相應微生物表達。厚壁菌門微生物與肥胖相關，腸道里的厚壁菌門微生物多于擬桿菌門微生物的情況下將使機體能夠充分吸收食物中的熱量從而引發(fā)肥胖[36]。乳酸桿菌和雙歧桿菌均是具有良好活性的益生菌，均能夠有效促進脂代謝，起到保持腸道健康、促進脂肪代謝、保持體重和減脂的作用[37-38]。本研究也證實發(fā)酵檸檬汁能夠促進小鼠腸道中產生更多的擬桿菌門微生物、乳酸桿菌和雙歧桿菌，而減少厚壁菌門微生物，從而通過調控腸道微生物起到促進脂肪代謝，發(fā)揮發(fā)酵檸檬汁的減脂作用。

圖5 小鼠糞便中厚壁菌門、擬桿菌門、乳酸桿菌和雙歧桿菌的mRNA表達Fig.5 mRNA expression of Firmicutes, Bacteroidetes,Lactobacillus sp. and Bifidobacterium sp.in mouse faeces

3 結論

本研究觀察了一種新發(fā)現(xiàn)的植物乳桿菌進行檸檬汁的發(fā)酵，通過動物實驗觀察了這種發(fā)酵檸檬汁對小鼠的減脂作用。實驗結果顯示，植物乳桿菌KFY02發(fā)酵檸檬汁能夠有效地調控肥胖小鼠的體質，器官指數(shù)、肝功能和血脂相關指標，還能夠調控肥胖相關的基因表達，從而發(fā)揮發(fā)酵檸檬汁的減脂作用。同時，本研究進一步顯示了植物乳桿菌KFY02發(fā)酵檸檬汁能夠調節(jié)小鼠腸道，使腸道微生物組成更為健康，從而保持機體健康和發(fā)揮減肥作用。但是本研究一方面對檸檬汁在發(fā)酵過程中成分的變化還研究不足，同時對腸道菌群的變化也缺乏更為細致的研究，另外還缺乏人體試驗的結果，因此在進一步的研究中，還需要加強以上三方面的研究。