紫色馬鈴薯花青素的抑菌性及其對(duì)草莓保鮮效果的研究

張海霞，包 良

（1.呼和浩特職業(yè)學(xué)院, 內(nèi)蒙古呼和浩特 010051；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)民族醫(yī)藥創(chuàng)新中心, 內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

花青素是存在于植物中的水溶性黃酮多酚類化合物[1-2]，可以起到抑菌、防突變、降血糖等作用[3]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健品和食品、化妝品中[4-5]。紫色馬鈴薯種植技術(shù)成熟，在我國(guó)的馬鈴薯主、次產(chǎn)區(qū)都有種植，產(chǎn)量大，其塊莖富含花青素，提取花青素具有來(lái)源豐富，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[6]，具有較好的開發(fā)前景。戴妙妙等[7]發(fā)現(xiàn)紫娟茶中花青素對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌能力。陳嬋等[8]報(bào)道紫甘薯原花青素對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，但是目前對(duì)紫色馬鈴薯花青素抑菌性和防腐性方面的報(bào)道較少。

關(guān)于草莓保鮮，目前廣泛應(yīng)用化學(xué)和生物保鮮法，孫娜等[9]對(duì)五葉草莓保鮮性研究發(fā)現(xiàn)，采用1%殼聚糖處理保鮮效果最好，趙亞珠等[10]用百里香精油制備抗菌紙箱儲(chǔ)藏草莓，能較好保持草莓的感官品質(zhì)。本試驗(yàn)研究紫色馬鈴薯花青素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌菌和酵母菌的抑菌性，并對(duì)紫色馬鈴薯花青素與對(duì)羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀單獨(dú)和結(jié)合使用的抑菌效果對(duì)比。同時(shí)對(duì)紫色馬鈴薯花青素對(duì)草莓的保鮮性能進(jìn)行了探討，以期為紫色馬鈴薯花青素作為生物抑菌劑和保鮮劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色馬鈴薯“黑美人” 采收于內(nèi)蒙古武川縣；草莓 采摘于呼和浩特討思浩種植大棚；LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、醋酸、氯化鉀、醋酸鈉、無(wú)水乙醇、磷酸、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀 均為分析純，內(nèi)蒙古愛爾法生物科技公司；大腸桿菌、酵母菌、青霉菌和金黃色葡萄球菌呼和浩特職業(yè)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室提供。

H/716M高速臺(tái)式離心機(jī)機(jī) 湖南赫西儀器公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-ID超凈工作臺(tái) 天津科賽特實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；WZS20折光儀 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DPX-9272生化培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫色馬鈴薯花青素的提取 取紫色馬鈴薯用自來(lái)水沖洗干凈削去表皮，切成薄片，干燥至恒重，打碎成粉末，過(guò)濾，收集篩下物。參照李玲等[11]的方法提取花青素，適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。稱取10 g紫色馬鈴薯粉末放于圓底蒸餾燒瓶與一定體積的1%酸化乙醇提取液按照液料比為20:1（mL/g）混勻，提取溫度65 ℃、超聲功率300 W條件下浸提。獲得的浸提液4500 r/min離心，萃取、蒸發(fā)、濃縮、真空干燥后得花青素提取物[12]，配制成 55、45、35、25、22.5、15、11.25、5.625、2.8125、1.40625 mg/mL 待用。

1.2.2 抑菌試驗(yàn)

1.2.2.1 菌懸液的制備 將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基表面，放置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～36 h[13]；青霉菌和酵母菌接種于PDA培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)48 h；活化后將上述供試菌接種在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)10～24 h左右[14]。調(diào)整各種菌懸液濃度為105CFU/mL待用。以下各處理均進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.2.2 紫色馬鈴薯花青素的抑菌性 通過(guò)濾紙擴(kuò)散法形成的抑菌區(qū)域直徑大小來(lái)評(píng)估紫色馬鈴薯花青素的抑菌效果。取上述菌懸液0.01 mL接種于各培養(yǎng)基平板上[15]；將濾紙打成直徑6 mm圓形小片，置潔凈小盒內(nèi)高壓滅菌，待其干燥后分別放入濃度為15、25、35、45和55 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素溶液中浸泡20 min，瀝干放入上述接菌培養(yǎng)板上，倒置培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量每種處理抑菌區(qū)域直徑[1]。

1.2.2.3 最低抑菌濃度（MlC） 采用二倍稀釋法，配制紫色馬鈴薯花青素水溶液，濃度分別為45、22.5、11.25、5.625、2.8125、1.40625 mg/mL，把滅菌后的濾紙片放入其中浸泡20 min，瀝干放入1.2.2.2各接菌培養(yǎng)板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)量每種處理抑菌區(qū)域直徑。判斷依據(jù)是無(wú)抑菌圈出現(xiàn)的最低濃度為紫色馬鈴薯花青素的最低抑菌濃度[16]。

1.2.2.4 紫色馬鈴薯花青素與對(duì)羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀單獨(dú)和結(jié)合使用的抑菌效果對(duì)比 將高壓蒸汽滅菌的濾紙片分別浸泡于25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素溶液、25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素+0.5 μg/mL對(duì)羥基苯甲酸乙酯溶液（體積比1:1）、25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素+5 μg/mL山梨酸鉀溶液（體積比1:1）、0.5 μg/mL對(duì)羥基苯甲酸乙酯溶液、5 μg/mL山梨酸鉀紫色馬鈴薯花青素溶液，浸泡20 min，瀝干放入1.2.2.1各接菌培養(yǎng)板上，測(cè)量每種處理抑菌區(qū)域直徑來(lái)判斷抑菌差異性。

1.2.3 紫色馬鈴薯花青素對(duì)草莓的保鮮性試驗(yàn)

1.2.3.1 草莓處理 鑒于對(duì)羥基苯甲酸乙酯是一種廣譜型食品添加劑，可應(yīng)用于多種類型物質(zhì)的保鮮，以下實(shí)驗(yàn)采用對(duì)羥基苯甲酸乙酯和花青素作為保鮮劑。取成熟度一致、果型相似、無(wú)損傷新鮮草莓120個(gè)，分成4組，稱重。3組草莓分別用25 mg/mL紫色馬鈴薯花青素溶液、0.5 μg/mL對(duì)羥基苯甲酸乙酯溶液、25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素+0.5 μg/mL對(duì)羥基苯甲酸乙酯混合液（體積比為1:1）浸泡10 min；以蒸餾水處理的一組為對(duì)照CK。各組處理后放于干凈濾紙吸干水分，用厚度為0.1 mm的普通PE保鮮膜單層包裝，室溫（26±2 ℃）保藏[4]，每隔 24 h 測(cè)定以下參數(shù)，共檢測(cè)5 d。所測(cè)參數(shù)均重復(fù)3次，分別取其均值。

1.2.3.2 失重率 采用稱重法計(jì)算1.2.3.1中4組草莓的失重率[9]。

式中：M0為處理前的質(zhì)量，g；Mi為第i天的質(zhì)量，g。

1.2.3.3 腐爛率 方法參考文獻(xiàn)[17]，草莓果肉有褐變、表面有霉斑或腐爛汁水流出判定為腐爛。統(tǒng)計(jì)

1.2.3.1 中4組草莓的腐爛率。

1.2.3.4 可溶性固形物含量（Brix值） 取1.2.3.1中4組草莓各10 g，研碎取汁用雙層紗布過(guò)濾，用手持折光儀測(cè)定草莓汁不同處理?xiàng)l件下的Brix值。

1.2.3.5 菌落總數(shù)測(cè)定 參照GB 4789.2-2016[18]《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》的方法對(duì)1.2.3.1中4組草莓菌落總數(shù)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖采用Excel 2010；顯著性分析采用SPSS Statistics 18.0和GraphPad8軟件分析。表中抑菌區(qū)直徑為三次平行的均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，包含抑菌濾紙片直徑6 mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫色馬鈴薯花青素對(duì)供試菌的抑菌性

2.1.1 紫色馬鈴薯花青素對(duì)不同供試菌的抑菌作用從表1可以看出，紫色馬鈴薯花青素對(duì)供試菌的抑制效果為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞青霉菌＞酵母菌。酵母菌對(duì)紫色馬鈴薯花青素不敏感，只有花青素溶液為高濃度時(shí)才會(huì)起作用，與陳虎[19]的研究結(jié)論一致。前三種供試菌隨著紫色馬鈴薯花青素濃度提高,抑菌區(qū)直徑都在增大，說(shuō)明高濃度花青素有利于增強(qiáng)抑菌效果。當(dāng)紫色馬鈴薯花青素濃度為55 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌的抑菌區(qū)直徑可達(dá)到15.73 mm。

表1 不同濃度紫色馬鈴薯花青素對(duì)供試菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of purple potato anthocyanins at different concentrations on the tested bacteria

2.1.2 紫色馬鈴薯花青素對(duì)不同供試菌的最低抑菌濃度（MIC） 根據(jù)表2得到，紫色馬鈴薯花青素對(duì)供試四種菌的最低抑菌濃度分別為11.25、5.625、22.5和45 mg/mL。在花青素濃度為45 mg/mL時(shí)，酵母菌的抑菌區(qū)直徑僅為6.27 mm，低于青霉菌的抑菌區(qū)直徑8.20 mm，但兩者抑菌區(qū)直徑都小于10 mm，說(shuō)明紫色馬鈴薯花青素對(duì)青霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)有影響，但作用效果不顯著（P＞0.05），再次證明酵母菌對(duì)花青素不敏感。

表2 紫色馬鈴薯花青素對(duì)供試菌的最低抑菌濃度（MIC）Table 2 MIC of purple potato anthocyanin solution on the tested bacteria

2.1.3 紫色馬鈴薯花青素與對(duì)羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀單獨(dú)和結(jié)合使用的抑菌效果對(duì)比 根據(jù)表3得出，紫色馬鈴薯花青素對(duì)前三種供試菌均具有抑制作用；對(duì)羥基苯甲酸乙酯和山梨酸鉀對(duì)供試四種菌都有影響；當(dāng)紫色馬鈴薯花青素分別與對(duì)羥基苯甲酸乙酯和山梨酸鉀混合使用時(shí)，前三種供試菌的抑菌區(qū)直徑都明顯大于用單一試劑處理的抑菌區(qū)直徑，說(shuō)明花青素有助于增強(qiáng)抑菌效果，青霉菌的抑菌區(qū)直徑可達(dá)到40.87 mm，增強(qiáng)效果最明顯；酵母菌的抑菌區(qū)直徑變化不明顯。

表3 紫色馬鈴薯花青素與對(duì)羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀單獨(dú)和結(jié)合使用抑菌效果對(duì)比Table 3 Comparison of antibacterial effects of purple potato anthocyanin, ethylparaben and potassium sorbate alone and in combination

2.2 紫色馬鈴薯花青素對(duì)草莓的保鮮作用

2.2.1 紫色馬鈴薯花青素對(duì)草莓腐爛率的影響 從圖1可以看出，采用不同方式處理的草莓腐爛率有明顯差異。CK從貯藏的第2 d腐爛率明顯升高，腐爛率顯著高于另外三組（P＜0.05）。4 d后，對(duì)照草莓、花青素處理草莓、對(duì)羥基苯甲酸乙酯處理草莓、花青素和對(duì)羥基苯甲酸乙酯混合液處理草莓腐爛率分別為79.7%、70.2%、50.0%和43.1%，表明處理過(guò)的草莓腐爛率顯著低于未處理草莓（P＜0.05）。用紫色馬鈴薯花青素和對(duì)羥基苯甲酸乙酯混合處理的草莓在試驗(yàn)期內(nèi)各階段腐爛率顯著低于花青素處理組（P＜0.05）。這可能是由于花青素的強(qiáng)抗氧化特性影響細(xì)菌的代謝反應(yīng)[20]，能抑制微生物的生長(zhǎng)，但是紫色馬鈴薯花青素單獨(dú)使用時(shí)對(duì)草莓腐爛率的影響小于對(duì)羥基苯甲酸乙酯。

圖1 不同處理對(duì)草莓腐爛率的影響Fig.1 Influence of different treatments on strawberry decay rate

2.2.2 紫色馬鈴薯花青素對(duì)草莓失重率的影響 草莓在貯藏中由于水分的蒸發(fā)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，會(huì)影響其外觀品質(zhì)和口感。由圖2可以看出，在儲(chǔ)藏1～5 d，各組草莓重量都有不同程度的變化。對(duì)照CK失重率上升幅度最高達(dá)到23.09%；其次是A、B和C。說(shuō)明不同處理方法在一定程度上能減緩草莓果實(shí)中水分的流失。單獨(dú)用花青素處理和對(duì)羥基苯甲酸乙酯處理后草莓失重率在第2、4和5 d差異不顯著（P＞0.05）；用花青素和對(duì)羥基苯甲酸乙酯復(fù)合處理組效果最佳，失重率顯著低于其它各處理組（P＜0.05）。

圖2 不同處理對(duì)草莓貯藏失重率的影響Fig.2 Influence of different treatments on the rate of weight loss in strawberry storage

2.2.3 紫色馬鈴薯花青素對(duì)草莓可溶性固形物含量的影響 可溶性固形物含量（Brix值）是反映果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及判斷果實(shí)耐貯藏能力的重要指標(biāo)[21-23]。根據(jù)圖3得到，在1～5 d，所有處理組草莓Brix值都在減少，可能是果實(shí)自身呼吸作用消耗糖分而使Brix值下降[17]。花青素+對(duì)羥基苯甲酸乙酯混合處理組草莓第1 d時(shí)Brix值為19.4%，第5 d時(shí)Brix值為13.2%，降低幅度為6.2%，顯著低于對(duì)羥基苯甲酸處理組和花青素處理組（P＜0.05）；對(duì)照草莓的Brix值降低幅度最多達(dá)到13.4%，顯著高于其它組（P＜0.05）。這可能是因?yàn)楸ｕr劑形成的透明薄膜，抑制了草莓采后貯藏期的呼吸作用[24]，減緩Brix值下降速度，延長(zhǎng)貨架期。用花青素處理的草莓Brix高于對(duì)照CK，但低于對(duì)羥基苯甲酸乙酯處理，說(shuō)明花青素在一定程度上可以抑制脫離母體的草莓果實(shí)的呼吸作用，但是單獨(dú)使用效果有限。

圖3 不同處理對(duì)草莓可溶性固形物含量的影響Fig.3 Influence of different treatments on the soluble solid content of strawberry

2.2.4 紫色馬鈴薯花青素對(duì)草莓菌落數(shù)的影響 如圖4所示,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組草莓菌落總數(shù)都出現(xiàn)升高趨勢(shì)。其中第1 d花青素+對(duì)羥基苯甲酸乙酯混合處理的草莓菌落總數(shù)最低（3.91 lg CFU/g），花青素處理草莓菌落數(shù)（4.41 lg CFU/g）低于對(duì)照CK（4.54 lg CFU/g）,但差異不顯著（P＞0.05）。第 2、3和5 d時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸乙酯處理草莓菌落數(shù)顯著低于對(duì)照CK（P＜0.001），花青素+對(duì)羥基苯甲酸乙酯混合處理草莓菌落數(shù)極顯著低于對(duì)照CK（P＜0.0001），說(shuō)明花青素能有效增強(qiáng)對(duì)羥基苯甲酸乙酯的抑菌效果?？傮w來(lái)看，紫色馬鈴薯花青素對(duì)草莓菌落數(shù)有影響，但效果差于對(duì)羥基苯甲酸乙酯和紫色馬鈴薯花青素+對(duì)羥基苯甲酸乙酯。

圖4 不同處理對(duì)草莓菌落總數(shù)的影響Fig.4 Influence of different treatments on the total number of strawberry colonies

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明紫色馬鈴薯花青素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌的生長(zhǎng)有抑制作用。對(duì)大腸桿菌桿菌和金黃色葡萄球菌的作用較好，青霉菌次之；只有花青素為高濃度時(shí)才會(huì)對(duì)酵母菌產(chǎn)生一定的抑制作用。紫色馬鈴薯花青素對(duì)四種供試菌的最低抑菌濃度（MIC）依次為 11.25、5.625、22.5和45 mg/mL。25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素與對(duì)羥基苯甲酸乙酯、山梨酸鉀結(jié)合使用有助于增強(qiáng)抑菌效果，從紫色馬鈴薯中提取的花青素可做為安全、無(wú)毒的生物抑菌性深度開發(fā)，與化學(xué)抑菌劑協(xié)同使用，可降低化學(xué)藥劑的使用劑量，應(yīng)用于食品和藥品中。

紫色馬鈴薯花青素對(duì)草莓具有一定保鮮效果。用25 mg/mL的紫色馬鈴薯花青素+0.5 μg/mL對(duì)羥基苯甲酸乙酯混合液處理組草莓的失重率、腐敗率顯著低于對(duì)照CK（P＜0.05），可溶性固形物含量顯著高于對(duì)照CK（P＜0.05），菌落總數(shù)極顯著低于對(duì)照CK（P＜0.0001）。保鮮能力依次為對(duì)羥基苯甲酸乙酯+花青素＞對(duì)羥基苯甲酸乙酯＞花青素。說(shuō)明紫色馬鈴薯花青素在一定程度上能抑制草莓水分的散失，減緩草莓呼吸速度，延長(zhǎng)儲(chǔ)藏時(shí)間，起到保鮮劑的作用，但其效果有效，與對(duì)羥基苯甲酸聯(lián)合使用效果最佳。微生物安全是食品中的關(guān)鍵問(wèn)題[25-26]。相比于化學(xué)保鮮防腐劑，花青素用作保鮮劑，天然、安全并節(jié)約成本，二者聯(lián)用可為新型環(huán)保生物防腐劑的開發(fā)提供一種新思路。