劉 凡,殷志康,劉 輝,崔智勇,閆 靜,吳菊清,辜雪冬,張 麗,馬 嫄,李春保,
(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095;2.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院,西藏林芝 860000;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;4.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039)
藏豬作為我國特有的高原型地方豬種,主要分布于西藏的林芝、昌都地區(qū),四川的甘孜、阿壩藏族自治州,甘肅甘南藏族自治州等地。藏豬因長期放養(yǎng)在高寒、低壓、低氧的高原環(huán)境中,形成了其生長緩慢、放養(yǎng)周期長、耐粗飼、抗病能力強(qiáng)的特點(diǎn)[1],在此天然生長環(huán)境下其形成的食用品質(zhì)特性得到肉品科學(xué)家們越來越多的關(guān)注。
肌纖維作為骨骼肌的基本組成單位,其組成類型與產(chǎn)肉動(dòng)物的產(chǎn)肉量及其肉品質(zhì)量密切相關(guān)[2-3]。根據(jù)肌球蛋白重鏈(MHC)的類型可以將肌纖維劃分為四種類型:慢速氧化型(I型)、快速氧化型(IIa)、中間型(IIx型)和快速糖酵解型(IIb型),不同的肌纖維類型具有不同的代謝活性,從I型到IIb型氧化能力逐漸降低,酵解能力逐漸增強(qiáng)[4]。研究表明,年齡、品種、部位和運(yùn)動(dòng)等因素會(huì)改變肌肉的肌纖維類型組成以及組織結(jié)構(gòu),從而影響宰后的肉質(zhì)。門小明[5]比較了不同雜交組合豬種的肌纖維類型組成與肉質(zhì)特性,發(fā)現(xiàn)肌肉中氧化型纖維比例與a*、肌內(nèi)脂肪含量、剪切力值呈顯著正相關(guān)。Shen等[6]比較了三個(gè)不同海拔的豬種:藏豬(高海拔)、梁山豬(中海拔)和三元豬(平原豬),發(fā)現(xiàn)高海拔品種藏豬和梁山豬比三元豬的pH更高、肉色更紅、剪切力更低,差異歸因于高原豬具有較高的氧化型肌纖維比例,降低了宰后糖酵解進(jìn)程,從而具有較好的肉質(zhì)。另外,肌內(nèi)結(jié)締組織也是肌肉組織的重要組成部分,一般來說,年齡越大、運(yùn)動(dòng)越多、負(fù)荷越大的部位因其具有強(qiáng)壯致密的結(jié)締組織支撐,肌肉剪切力越大,嫩度越差[7]。張盼等[8]測定了林芝藏豬在放牧與舍飼兩種不同飼養(yǎng)方式下的屠宰性能和肉品質(zhì),發(fā)現(xiàn)舍飼可增加藏豬的個(gè)體體重和胴體重量,提高肌內(nèi)脂肪含量和大理石紋評分,改善肌肉嫩度。純正的藏豬常年放養(yǎng)于高原地區(qū),因其生長緩慢體型偏小,出欄期一般在一年以上,而市售的平原大白豬集中圈養(yǎng)且生長速度快,一般8~10月齡即可進(jìn)行屠宰。目前關(guān)于藏豬食用品質(zhì)的研究普遍是將藏豬與平原豬置于相同飼養(yǎng)條件下、飼養(yǎng)相同日齡進(jìn)行比較[6,9],并不能客觀反映出天然放養(yǎng)狀態(tài)下藏豬的肉質(zhì),而且主要針對單個(gè)地區(qū)藏豬的研究,并不能反映出不同產(chǎn)地藏豬的差異性及特色。
為了研究高原藏豬的食用品質(zhì)特性,并從結(jié)合實(shí)際飼養(yǎng)條件和生長狀況探究其肉質(zhì)形成原因,本研究以不同地區(qū)(西藏林芝、甘肅甘南、四川阿壩)自然放養(yǎng)下的藏豬與普通圈養(yǎng)大白豬為研究對象,測定其食用品質(zhì)(pH、顏色、蒸煮損失、剪切力)、肌紅蛋白含量、羥脯氨酸含量以及不同的MyHC mRNA相對表達(dá)量,揭示高原藏豬肌肉纖維類型組成的品種差異及與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性,并結(jié)合藏豬的實(shí)際生產(chǎn)現(xiàn)狀,為藏豬產(chǎn)業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。
正常發(fā)育公豬(已去勢) 1歲齡的林芝藏豬10頭,海拔3000 m自然放牧條件下,西藏林芝巴宜區(qū)八一鎮(zhèn)提供;甘南藏豬 9頭 甘肅省甘南夏河縣博友蕨麻豬養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社提供;阿壩藏 豬10頭,四川阿壩小金縣綠野養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供;去勢三元公豬 10頭,10月齡,江蘇省食品集團(tuán)有限公司;此處的1歲齡和10月齡選擇是依據(jù)實(shí)際市售白豬和藏豬的年齡。宰殺后采集背最長肌各1 kg肉樣(從宰殺到完成肉樣采集約耗時(shí)3 h),經(jīng)液氮速凍后真空包裝、干冰運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室,于-18 ℃保存,待測食用品質(zhì),同時(shí)取10 g肉樣于凍存管中-80 ℃保存,待測基因表達(dá)量;因采樣條件受限,林芝藏豬肉樣統(tǒng)一采集于50 mL離心管中,-80 ℃保存;氯化鉀、碘乙酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸、一水檸檬酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、氯胺T、對二氨基苯甲醛、高氯酸、異丙醇均為國產(chǎn)分析純;TRizol 北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒 南京邁博生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒 日本Takara公司。
Fiveeasy臺(tái)式 pH計(jì) 瑞士 Mettler Toledo公司;PD500-TP勻漿機(jī) 英國 PRIMA 公司;CR-300色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司;DGG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Avanti J-C高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司;TW20水浴鍋 德國Julabo公司;渦旋儀 上海瀘西分析儀器有限公司;純水機(jī)、QuantStudio 6Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國Thermo 公司;AUY120電子分析天平 日本島津公司;組織破碎儀 法國Bertin公司;C-LM3B數(shù)顯式肌肉嫩度儀東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院;Synergy-2酶標(biāo)儀 美國Biotek公司。
1.2.1 食用品質(zhì)測定
1.2.1.1 pH 參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2793-2015《肉的食用品質(zhì)客觀評價(jià)方法》[10]。稱取1 g肉樣絞碎,加入9 mL 5 mmol/L氯化鉀、碘乙酸鈉溶液(pH7.0),4 ℃、6000 r/min 勻漿 30 s,過濾,攪拌的同時(shí)將已校準(zhǔn)的電極插入勻漿液中,待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄pH,每個(gè)樣品測三次取平均值。
1.2.1.2 肉的顏色 參照NY/T 2793-2015的方法,將凍肉置于4 ℃環(huán)境下解凍,將解凍后的肉樣垂直肌纖維方向切成5 cm×4 cm×2 cm大小的肉塊,將肉樣平放在紅色塑料板或托盤上,新切面朝上,避光靜置 30 min。將色差儀的鏡頭垂直置于肉面上,記錄亮度(L*)、紅色度(a*)、黃色度(b*),每個(gè)樣品測三次取平均值。
1.2.1.3 蒸煮損失 參照NY/T 2793-2015的方法,稍作修改。將凍肉置于4 ℃環(huán)境下解凍,擦去表面汁液,垂直肌纖維方向切成5 cm×4 cm×2 cm大小的肉塊,稱重(m1),將肉塊置于蒸煮袋內(nèi),將溫度計(jì)插入肉的中心部位,78 ℃水浴加熱肉塊至中心溫度75 ℃,流水冷卻30 min后取出肉塊,表面汁液用濾紙吸干,稱重(m2),蒸煮損失率(%)計(jì)算公式為:
式中:X表示蒸煮損失率,%;m1表示水煮前肉塊的質(zhì)量,g;m2表示水煮擦干后肉塊的質(zhì)量,g。
1.2.1.4 剪切力 用測完蒸煮損失的肉塊去測剪切力,具體操作為:用雙片刀沿肌纖維方向分切成多個(gè)1.0 cm厚的肉柱,用嫩度儀垂直于肌纖維方向測量剪切力,測試速度為1.0 mm/s,每個(gè)樣品測3次取平均值。
1.2.2 肌紅蛋白測定 參照Krzywicki等[11]方法,取肉樣1 g,加入5 mL磷酸鈉緩沖液(0.04 mol/L,pH6.8),用組織破碎儀10000 r/min均質(zhì)25 s,置均質(zhì)液于 4 ℃ 環(huán)境中靜置 1 h,然后 4500×g、4 ℃ 離心20 min。將上清液用0.45 μm水系濾膜過濾,濾液用酶標(biāo)儀分別在525、545、565和572 nm處測其吸光值。計(jì)算公式如下:
總肌紅蛋白 (μmol/g)=-0.166A572+0.086A565+0.088A545+0.099A525
P1(%)=(0.369R1+1.140R2-0.941R3+0.015)×100
P2(%)=(0.882R1-1.267R2+0.809R3-0.361)×100
P3(%)=(-2.541R1+0.777R2+0.800R3+1.098)×100
式中:P1、P2、P3分別為肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%);R1、R2、R3分別式吸光度比值 A572/A525、A565/A525、A545/A525。
1.2.3 羥脯氨酸含量測定 參考GB/T 9695.23-2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》[12],取4 g 肉加30 mL硫酸在105 ℃烘箱中消解16 h,濾紙過濾后定容待測。
1.2.4 基因相對表達(dá)量測定 參照楊玉瑩等[13]的方法,按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA,用微量核酸蛋白測定儀分析測定OD260nm/OD280nm并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)體系30 μL,反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 保溫,將 cDNA 于-20 ℃ 保存,用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因,MYH7、MYH2、MYH4、MYH1為目的基因,分別編碼肌球蛋白重鏈MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIb 和 MyHC IIx,實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成,引物序列如表1。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL,按照試劑盒要求進(jìn)行PCR反應(yīng)液的配制,每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行。采用2-ΔΔCt法作為相對基因表達(dá)量的分析方法,標(biāo)準(zhǔn)曲線通常被用來確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率,目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)為ΔCt,ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH),ΔΔCt=ΔCt(其他樣本)-ΔCt(對照樣本)。
所有指標(biāo)每組至少進(jìn)行8個(gè)生物學(xué)重復(fù),使用SAS9.1.2統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各組間的差異顯著性采用 Duncan’s Multiple Comparison,P<0.05為差異顯著。各指標(biāo)相關(guān)性分析采用Person相關(guān)系數(shù),以雙側(cè)方式驗(yàn)證顯著性;使用Graphpad Prism7.0軟件進(jìn)行圖表繪制。
pH是反映宰后肉質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo),從表2可以看出,三個(gè)地區(qū)藏豬肉pH3h(5.71~5.78)均處于正常范圍,且顯著低于大白豬的pH3h(6.05±0.20)(P<0.05),可能是藏豬因?yàn)殚L期的高原低氧應(yīng)激,體內(nèi)能量代謝較快,導(dǎo)致宰后pH快速下降[14-16]。
表2 不同地區(qū)豬pH3 h和色澤比較Table 2 Comparison of pH3 h and color of pig from different regions
肉的色澤是影響消費(fèi)者購買欲最直觀的因素,不同地區(qū)豬肉顏色比較見表2,與大白豬相比,三個(gè)地區(qū)藏豬總體呈現(xiàn)出低L*、高a*的特點(diǎn)(P<0.05),這與Gan等[17]的研究結(jié)果一致,其中,阿壩藏豬的a*為 8.10,顯著高于甘南藏豬和林芝藏豬(P<0.05),說明阿壩藏豬比其他兩個(gè)地區(qū)的肉色更紅,可能是因?yàn)樗拇ú刎i的肌肉中含有更多的肌紅蛋白,下一步將進(jìn)行測定。
肉色是由肌紅蛋白和血紅蛋白的數(shù)量決定的,二者的含量決定肉色的深淺。動(dòng)物經(jīng)過充分放血之后,其顏色深淺主要由肌紅蛋白含量決定。從圖1可以看出,藏豬的肌紅蛋白含量顯著高于大白豬(P<0.05),且不同地區(qū)藏豬肉的肌紅蛋白含量存在顯著差異,總體表現(xiàn)為阿壩藏豬(0.09 μmol/g)>甘南藏豬(0.08 μmol/g)>林芝藏豬(0.06 μmol/g)>大白豬(0.04 μmol/g),這也解釋了前面阿壩藏豬肉色最紅的結(jié)果,這是其對缺氧的適應(yīng)性體現(xiàn)。藏豬常年放養(yǎng)于高寒、低壓、低氧的環(huán)境,其體內(nèi)需要充足的肌紅蛋白來增強(qiáng)與氧的親和力,提高有氧代謝產(chǎn)能,從而維持正常的生命活動(dòng)[18]。早在2013年,Li等[19]對藏豬和家豬進(jìn)行全基因組測序?qū)Ρ确治?,發(fā)現(xiàn)與其他低海拔哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的12個(gè)鐵蛋白基因相比,藏豬的鐵蛋白家族中27個(gè)基因出現(xiàn)擴(kuò)增,對藏豬的高原低氧適應(yīng)性起著重要的作用。
圖1 不同地區(qū)豬肌紅蛋白含量比較Fig.1 Comparison of myoglobin content of pig from different regions
生肉在加熱時(shí)蛋白質(zhì)受熱變性,使得肌原纖維發(fā)生緊縮,從而失去水分。從圖2A可以看出,阿壩藏豬和甘南藏豬的蒸煮損失率(25.08%、23.70%)均高于大白豬(22.28%),表明藏豬的系水力較差,可能與藏豬較低的pH有關(guān),宰后pH下降較快的肌肉往往會(huì)伴隨有較大的汁液滲出,從而會(huì)導(dǎo)致其在熱加工過程中損失較多水分[20]。如圖2B所示,阿壩藏豬和甘南藏豬的剪切力分別為57.69和64.01 N,差異不顯著(P>0.05),均顯著高于大白豬 41.81(P<0.05),表明藏豬肉嫩度較差,這與前人發(fā)現(xiàn)藏豬肉細(xì)嫩多汁的結(jié)果相悖[6,11],可能是因?yàn)槠浔容^的是相同圈養(yǎng)條件下藏豬與大白豬的肉質(zhì),而本實(shí)驗(yàn)研究的是天然放養(yǎng)的藏豬,運(yùn)動(dòng)量較大,肌肉更加緊實(shí)有力,導(dǎo)致肉的嫩度變差,因而需要的剪切力更大(因高原采樣條件特殊,林芝藏豬的樣品不夠做蒸煮損失和剪切力的實(shí)驗(yàn),疫情原因無法進(jìn)行再次前往西藏采樣,故此處只比較了阿壩藏豬和甘南藏豬)。
圖2 不同地區(qū)豬蒸煮損失(A)和剪切力(B)比較Fig.2 Comparison of cooking loss (A) and shear force (B) of pig from different regions
肌內(nèi)結(jié)締組織是肌肉組織的重要組成部分,對肉的質(zhì)地和品質(zhì)具有重要影響。膠原蛋白是結(jié)締組織的主要成分,對維持肌肉的彈性具有重要作用。羥脯氨酸作為結(jié)締組織中膠原蛋白的主要成分之一,在膠原蛋白中組成恒定(占總氨基酸的12%~14%),其含量可以側(cè)面反映出肌肉中結(jié)締組織的含量[21]。
由表3可以看出,藏豬的羥脯氨酸含量(6.95%~7.49%)顯著高于大白豬 5.92%(P<0.05),說明藏豬肉中結(jié)締組織含量較高,可能是因?yàn)椴刎i比大白豬出欄期更長,運(yùn)動(dòng)量更大,研究表明,年齡越大、運(yùn)動(dòng)越多、負(fù)荷越大的部位因具有強(qiáng)壯致密的結(jié)締組織支撐[7],并且隨著年齡的增加,結(jié)締組織中的成熟交聯(lián)(賴氨酸吡啶和羥賴氨酸吡啶)呈現(xiàn)上升趨勢,膠原蛋白的溶解性降低,導(dǎo)致肌肉剪切力越大,嫩度越差[22]。結(jié)合前面藏豬肉剪切力更大的結(jié)果,說明較高的結(jié)締組織含量可能是導(dǎo)致藏豬肉嫩度差的一個(gè)重要原因。
表3 不同地區(qū)豬羥脯氨酸含量比較Table 3 Comparison of hydroxyproline content of pig in different regions
圖3A結(jié)果顯示了不同地區(qū)豬肌球蛋白重鏈的4種亞型,即 MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIb 和 MyHC IIx,可以看出三個(gè)地區(qū)藏豬的IIa型肌纖維含量顯著高于大白豬(P<0.05)和IIx型肌纖維含量顯著低于大白豬(P<0.05),甘南藏豬和林芝藏豬的I型、IIb型肌纖維含量顯著低于阿壩藏豬和大白豬(P<0.05)。
圖3 不同地區(qū)豬肌纖維相關(guān)基因mRNA表達(dá)量(A)和不同基因mRNA相對表達(dá)量所占比例(B)Fig.3 mRNA expression of muscle fiber related genes in pigfrom different regions (A) And the proportion of mRNA expression of different genes (B)
圖3B為mRNA相對表達(dá)量所占比例,可以看出四個(gè)地區(qū)背最長肌均以酵解型肌纖維為主,整體呈現(xiàn)出 MyHC IIb>MyHC IIx>MyHC I>MyHC IIa,不同的是,大白豬以IIb型肌纖維為主(71.29%),其次是 IIx型(22.17%)、I型(7.82%)、IIa型(0.94%),而三個(gè)地區(qū)藏豬均以IIb和IIx型肌纖維為主,其次是I型和IIa型,比例分別為阿壩藏豬(36.94%、32.98%、23.03%、7.05%)、甘南藏豬(32.0%、26.09%、25.74%、15.77%)、林芝藏豬(41.41%、38.64%、9.58%、8.14%),藏豬的I型和IIa型肌纖維比例顯著(P<0.05)高于大白豬,這是因?yàn)椴刎i長期生活在高寒缺氧環(huán)境中,需要通過提高有氧代謝產(chǎn)生更多的能量來維持機(jī)體的生命活動(dòng)[14]。另一方面,藏豬較高的氧化型肌纖維比例可能與其獨(dú)特的生活環(huán)境和放養(yǎng)方式有關(guān),大白豬常年圈養(yǎng)運(yùn)動(dòng)量少,而藏豬普遍放養(yǎng)于海拔3000 m的高寒環(huán)境,善于奔跑運(yùn)動(dòng)量大,有研究表明,長期處于寒冷、運(yùn)動(dòng)的情況下可能會(huì)導(dǎo)致IIb型肌纖維的轉(zhuǎn)變成I型和IIa型肌纖維[23-24]。
各指標(biāo)間相關(guān)性分析結(jié)果如表4所示,L*與a*呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),a*與肌紅蛋白含量、I型和IIa型肌纖維呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與IIb型肌纖維呈負(fù)相關(guān),這是因?yàn)檠趸图±w維比酵解型肌纖維含有更多肌紅蛋白[25],從而導(dǎo)致較紅的肉色;IIa型肌纖維與剪切力、羥脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05),說明IIa型肌纖維比例越高,羥脯氨酸含量越高,可能是導(dǎo)致藏豬肉剪切力大、嫩度差的原因。以上結(jié)果表明,藏豬與大白豬肉質(zhì)存在顯著差異,這與其肌纖維類型組成有很大關(guān)系。
表4 肌肉品質(zhì)與肌纖維類型相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between meat quality and muscle fiber type
本研究通過比較不同地區(qū)的高原藏豬與平原豬(大白豬)肉的食用品質(zhì),發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)藏豬肉與平原豬肉的食用品質(zhì)存在一定差異,并從肌纖維類型角度解釋了不同地區(qū)肉質(zhì)的形成原因,為藏豬的實(shí)際生產(chǎn)提供了一定的理論指導(dǎo)。主要結(jié)論如下:與大白豬相比,藏豬的pH3h更低(處于5.7~6.1之間)、肉色更紅、剪切力更大。不同地區(qū)藏豬相比,阿壩藏豬的肉色最紅(a*為8.10)。同時(shí),藏豬特有的生活習(xí)性導(dǎo)致其肌肉中含有更多的肌紅蛋白、結(jié)締組織和氧化型肌纖維。相關(guān)性分析表明,a*與肌紅蛋白含量、I型和IIa型肌纖維呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),IIa型肌纖維與剪切力、羥脯氨酸含量呈正相關(guān),說明較高的氧化型肌纖維比例與肌紅蛋白含量是藏豬肉色紅的原因,同時(shí),放養(yǎng)周期長以及運(yùn)動(dòng)量大,導(dǎo)致藏豬肌肉中含有有較多的羥脯氨酸,可能是導(dǎo)致藏豬肉嫩度差的一個(gè)重要原因,建議通過適當(dāng)圈養(yǎng)、縮短育肥期來改善藏豬肉的嫩度。
此外,藏區(qū)因地形偏遠(yuǎn),屠宰條件相對落后,很多影響宰后肉質(zhì)的因素(如驅(qū)趕方式、衛(wèi)生條件等)并沒有得到重視,若能將現(xiàn)代肉品科學(xué)研究成果應(yīng)用于高原地區(qū)的畜牧業(yè),可為提高畜產(chǎn)品品質(zhì),促進(jìn)高原畜牧業(yè)的發(fā)展創(chuàng)造基礎(chǔ)。