花椒渣超臨界CO2萃取物成分及其活性分析

趙慧娟，許騰騰，趙 楠，劉尊英,

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東青島 266003；2.利和味道(青島)食品產(chǎn)業(yè)股份有限公司, 山東青島 266109）

花椒屬于蕓香科花椒屬植物（Zanthoxylum bungeanum），其干燥成熟果皮因具有芳香濃郁、醇麻爽口的特點(diǎn)而被用做香辛料，是人們常用的食品調(diào)味料[1]。花椒提取物主要含有揮發(fā)油、生物堿、酰胺、香豆素、脂肪酸，還有黃酮類、多酚類等物質(zhì)[2-4]，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抑制血小板凝集作用[5-6]。Pang等[7]研究表明花椒精油可以通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)抑制黑色素瘤細(xì)胞的入侵和增殖，阻斷信號(hào)通路。因此，花椒提取物在食品抑菌[8]、生物藥理等方面具有很大的發(fā)展前景。

花椒提取物的制備方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑浸提法等，但這些方法存在提取率低、有機(jī)溶劑殘留等缺點(diǎn)，而超臨界CO2萃取技術(shù)是一種先進(jìn)的綠色萃取技術(shù)，利用超臨界CO2流體的高滲透力和高溶解力萃取分離提取物，提取過(guò)程無(wú)毒無(wú)害、價(jià)格低廉易獲取，逐漸實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用[9-11]。Carlotta等[12]運(yùn)用超臨界CO2流體萃取技術(shù)，從低價(jià)值的雜草和農(nóng)業(yè)廢棄物中有效提取了潛在的抗菌化合物和防腐劑成分。

在超臨界CO2萃取花椒油的工業(yè)化制備過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的花椒渣料，多被直接丟棄，造成資源浪費(fèi)。本研究利用超臨界CO2流體萃取技術(shù)，對(duì)花椒渣料進(jìn)行進(jìn)一步的萃取，通過(guò)色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）技術(shù)鑒定渣料提取物中的小分子化合物，并研究花椒渣萃取物的抑菌作用與抗氧化作用，以期為花椒渣的高值化利用提高理論依據(jù)及基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貢椒 利和味道（青島）食品產(chǎn)業(yè)股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸 色譜純，Merck KGaA； DPPH、ABTS 索萊寶生物科技有限公司；其他試劑 均為化學(xué)分析純；供試菌株副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、希瓦氏菌（Shewanella）、酵母菌（Saccharomyces） 為實(shí)驗(yàn)室保存菌株，經(jīng)過(guò)活化后使用；LB瓊脂培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂15 g，1 L）、LB肉湯培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g，1 L） 121 ℃滅菌20 min備用。

HA220-50-06超臨界CO2萃取裝置 南通市華安超臨界萃取有限公司；UHPLC超高效液相色譜儀、Q-Exactive HF高分辨質(zhì)譜 Thermo Fisher Scientific 公司；Zorbax Eclipse C18（1.8 μm×2.1×100 mm）色譜柱 Agilent technologies公司；多功能酶標(biāo)儀Molecular Devices公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 四種花椒萃取物的制備 花椒萃取物的制備：以貢椒為原料，經(jīng)粗略粉碎后，進(jìn)行超臨界CO2萃取，萃取條件為壓力25 MPa，溫度40 ℃，時(shí)間5 h，萃取完成后分離得到花椒油樹(shù)脂。

花椒渣萃取物的制備：以花椒萃取物剩余渣料為原料，以95%乙醇為夾帶劑，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)得到較優(yōu)提取條件為：夾帶劑流量20 mL/min，溫度45 ℃，壓力25 MPa，時(shí)間5 h，經(jīng)減壓分離得到花椒渣萃取物。

精油和麻素分離物的制備：將花椒油樹(shù)脂再次超臨界萃取進(jìn)行二次精制分離，改變萃取溫度和壓力分離得到花椒精油分離物，在萃取釜中回收得到花椒麻素分離物。

上述萃取物及分離物用無(wú)水乙醇溶解稀釋至400 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：C18色譜柱（Zorbax Eclipse C18（1.8 μm×2.1×100 mm））；流動(dòng)相 A為0.1%甲酸溶液（含10 mmol/L甲酸銨）；B為純乙腈；洗脫梯度（0～2 min，B 5%；2～7 min，B 30%；7～14 min，B 78%；14～20 min，B 95%；20～25 min，B 5%）；柱溫為 30 ℃；流速 0.3 mL/min；進(jìn)樣量為 2 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃[13]。

質(zhì)譜條件：正離子模式：加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；吹掃氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.5 kV；毛細(xì)管溫度：330 ℃；SLens RF Level：55%。

掃描模式：一級(jí)全掃描（Full Scan，m/z 100～1500）與數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描（dd-MS2，TopN=10）；分辨率：120000（一級(jí)質(zhì)譜） & 60000（二級(jí)質(zhì)譜）。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）[13]。

定性、定量：使用Compound Discoverer 3.1對(duì)質(zhì)譜峰進(jìn)行分析矯正處理，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜信息利用Thermo mzCloud在線數(shù)據(jù)庫(kù)，Thermo mzValut本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)等，進(jìn)行物質(zhì)鑒定。

1.2.3 抑菌效力測(cè)定 抑菌效力測(cè)定采用濾紙片擴(kuò)散法，參考文獻(xiàn)[5,14]稍作修改，將直徑6 mm的圓濾紙片滅菌后浸泡在各樣品中12 h，然后貼在涂布有菌液的LB固體培養(yǎng)基上，溶劑浸泡濾紙片作為對(duì)照；將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h，觀察各菌的生長(zhǎng)情況并記錄數(shù)據(jù)，重復(fù)三次。

1.2.4 最小抑菌濃度測(cè)定 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定采用二倍試管稀釋法，參考文獻(xiàn)[5,15]稍作修改，取9支試管編號(hào)1～9，在1～7號(hào)試管中樣品終濃度為 50、25、12.5、6.25、3.125、1.5、0.7 mg/mL；在1～8號(hào)試管中加入菌液50 μL，9號(hào)試管為培養(yǎng)基空白對(duì)照；各管終體積2 mL，將各試管于28 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況確定最小抑菌濃度MIC，并將無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的試管取50 μL倒板，觀察有無(wú)菌體生長(zhǎng)。每個(gè)樣品重復(fù)三次。

1.2.5 DPPH自由基清除率測(cè)定 DPPH自由基清除率測(cè)定參考文獻(xiàn)[16-17]的方法進(jìn)行，測(cè)定前用無(wú)水乙醇將樣品稀釋成系列梯度：150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5 mg/mL。用無(wú)水乙醇溶解二苯代苦味?；―PPH），終濃度為0.1 mmol/L，避光儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?.5 mL DPPH溶液，與50 μL待測(cè)樣品液混勻，在48孔板中室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，記為A1；將1.5 mL無(wú)水乙醇和50 μL樣品混勻測(cè)定值記為A2，1.5 mL DPPH與50 μL無(wú)水乙醇混勻測(cè)定值記為A0。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.2.6 ABTS+自由基清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[17-18]等方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前用無(wú)水乙醇將樣品稀釋成系列梯度：150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5 mg/mL。ABTS儲(chǔ)備液配置：用純凈水配制含7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液的儲(chǔ)備液，暗室避光放置12～16 h。ABTS應(yīng)用液：將儲(chǔ)備液用無(wú)水乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光值為0.7±0.02（大約 40～50 倍）。取 1.5 mL ABTS 溶液，與 50 μL待測(cè)樣品液混勻，在48孔板中室溫避光反應(yīng)6 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，記為A1；將1.5 mL無(wú)水乙醇和50 μL樣品混勻測(cè)定值記為A2，1.5 mL ABTS與50 μL無(wú)水乙醇混勻測(cè)定值記為A0。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。自由基清除率計(jì)算公式同式（1）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件（Statistical Product and Service Solutions，SPSS），數(shù)據(jù)作圖采用Origin軟件。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。處理間差異采用鄧肯氏多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒渣萃取物L(fēng)C-MS/MS分析

經(jīng)LC-MS/MS檢測(cè)，花椒提取物中共檢出68種化合物，其中花椒渣萃取物共有50種，檢出化合物占萃取物的91.32%，LC-MS/MS離子譜圖如圖1～圖4所示。從表1可以看出，不同的分離提取條件，化合物成分不同，花椒渣萃取物和花椒萃取物以及花椒麻素的成分含量相近，但與花椒精油的差異較大，可能因?yàn)榛ń肪椭卸酁閾]發(fā)性成分?；ń诽崛∥锏闹饕煞钟猩飰A、烯醇、香豆素、多酚，還含有類固醇、酰胺、黃酮等物質(zhì)，與其他研究[5,10,19]結(jié)果一致。在花椒渣萃取物、花椒萃取物、麻素分離物中，石斛堿、胺環(huán)戊酯和噴布特羅三種物質(zhì)相對(duì)含量達(dá)60%以上，其中石斛堿的含量最高，分別占38.28%、35.79%、37.19%。石斛堿是一種吡咯里西啶衍生物類生物堿，研究表明石斛堿具有較好的藥用功效，在抗炎癥、心血管保護(hù)、神經(jīng)系統(tǒng)和糖脂代謝調(diào)控[20]等方面效果顯著[21]。在精油分離物中，石斛堿、姜黃烯和吐納麝香的相對(duì)含量較高，占比38.7%。另外有研究表明黃酮類、生物堿、氨基酸、酚酸等物質(zhì)多是導(dǎo)致花椒苦味特征的化合物[22]。

表1 四種花椒提取物的成分組成Table 1 Components of of the four Zanthoxylum bungeanum extracts

圖1 花椒渣萃取物L(fēng)C-MS/MS離子圖譜Fig.1 LC-MS/MS ion-chromatogram of Zanthoxylum bungeanum residue extract

圖2 花椒萃取物L(fēng)C-MS/MS離子圖譜Fig.2 LC-MS/MS ion-chromatogram of Zanthoxylum bungeanum extract

圖3 麻素分離物L(fēng)C-MS/MS離子圖譜Fig.3 LC-MS/MS ion-chromatogram of zanthoxylin

圖4 精油分離物L(fēng)C-MS/MS離子圖譜Fig.4 LC-MS/MS ion-chromatogram of Zanthoxylum bungeanum essential oil

續(xù)表1

從LC-MS/MS分析結(jié)果可以看出花椒渣萃取物中的活性成分及其含量與花椒萃取物相似，某些成分含量甚至更高，因此花椒渣具有較高的利用價(jià)值，可以在提供活性成分的同時(shí)實(shí)現(xiàn)花椒廢棄渣料的高值化利用。

2.2 花椒渣萃取物的抑菌活性

2.2.1 花椒渣萃取物抑菌效力定性分析 從表2可以看出，花椒渣萃取物對(duì)8種試驗(yàn)菌均具有一定的抑制作用，其中對(duì)副溶血弧菌和希瓦氏菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌的抑制作用較弱?；ń吩腿∥锉憩F(xiàn)出的抑菌活性可能與萃取物中的多酚、黃酮類、生物堿等含量密切相關(guān)[23]。此外，花椒萃取物、麻素分離物和精油分離物對(duì)試驗(yàn)菌株也表現(xiàn)出一定的抑菌作用，表明花椒提取物具有廣譜的抑菌性，與Yu等研究結(jié)果一致[24]。四種組分中，花椒精油表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌作用，伍燕等[17]的研究表明，花椒精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有較好的抑制性，其中對(duì)大腸桿菌的抑制效果相對(duì)較弱?；ń吩腿∥铩⒒ń份腿∥锖吐樗胤蛛x物雖然成分相近，但其具體含量存在差異，并且不同的試驗(yàn)菌對(duì)各物質(zhì)也表現(xiàn)出不同的敏感性，因此表現(xiàn)出不同的抑菌效力。

表2 四種花椒提取物的抑菌效力Table 2 Antibacterial efficacy of four kinds of Zanthoxylum bungeanum extracts

2.2.2 花椒渣萃取物對(duì)各供試菌株的最小抑菌濃度最小抑菌濃度結(jié)果表明，不同提取物對(duì)不同菌種的MIC存在較大差異（表3），花椒渣萃取物對(duì)副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌和希瓦氏菌的抑制作用最強(qiáng)，其MIC均為3.125 mg/mL，其次為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌，其MIC分別為6.25和12.5 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的抑制作用最弱，其MIC為25 mg/mL，結(jié)果與抑菌效力實(shí)驗(yàn)一致。其他提取物中，精油分離物的抑菌性較強(qiáng)，對(duì)副溶血弧菌、希瓦氏菌以及釀酒酵母的MIC為均為0.7 mg/mL，花椒萃取物與麻素分離物抑菌作用較弱。

表3 四種花椒提取物的最小抑菌濃度MICTable 3 MIC of four kinds of Zanthoxylum bungeanum extracts

2.3 花椒渣萃取物的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率 提取物的DPPH自由基清除率如圖5所示，花椒渣萃取物的清除率最高，在50 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到91.35%，而花椒萃取物和麻素分離物只有38.27%和59.42%，清除率呈濃度依賴性，存在顯著性差異（P＜0.05）。精油分離物的清除率最低，在150 mg/mL的濃度下，清除率只有12.4%，可能與提取成分的化合物種類和相對(duì)含量有關(guān)。由此可見(jiàn)，DPPH自由基清除能力大?。夯ń吩腿∥铮韭樗胤蛛x物＞花椒萃取物＞精油分離物。

圖5 四種花椒提取物的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging rates of four Zanthoxylum bungeanum extracts

2.3.2 ABTS+自由基清除率 提取物的ABTS+自由基清除率如圖6所示，各萃取物的自由基清除能力呈濃度依賴性，其中花椒渣提取物的清除率最高，在12.5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到100%，麻素分離物在50 mg/mL時(shí)達(dá)到99.48%，花椒提取物在100 mg/mL時(shí)達(dá)到99.33%，精油分離物的清除率最低，在150 mg/mL的濃度下，清除率只有46.89%，根據(jù)前文成分分析結(jié)果可知，抗氧化能力的差異可能與主要成分及其含量相關(guān)，各提取物之間存在差異顯著性（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，ABTS+自由基清除能力大小：花椒渣萃取物＞麻素分離物＞花椒萃取物＞精油分離物。

圖6 四種花椒提取物的ABTS+自由基清除率Fig.6 ABTS+ free radical scavenging rates of four Zanthoxylum bungeanum extracts

3 結(jié)論與討論

本研究聯(lián)合超臨界CO2流體及95%乙醇夾帶劑制備了花椒渣萃取物，通過(guò)LC-MS/MS成分分析鑒定了花椒渣萃取物中共有50種化合物，主要包括生物堿、烯醇、香豆素、黃酮類、酰胺類等物質(zhì)，并且主要成分石斛堿的相對(duì)含量達(dá)到了38.28%，有研究表明石斛堿具有較好的藥用價(jià)值[25]。柴麗琴等[19]采用GC-MS對(duì)花椒油樹(shù)脂進(jìn)行分析，其結(jié)果主要是烯醇類、酯類、萜類、花椒素等化合物，與本研究結(jié)果一致，但其主成分物質(zhì)為花椒素，含量達(dá)到10.85%，這與花椒的產(chǎn)地、品種、工藝條件、測(cè)定方法等因素有關(guān)?；ń吩腿∥锏奈镔|(zhì)成分和相對(duì)含量與花椒萃取物、麻素分離物相似，但與精油分離物差異較大，因?yàn)楦酄钶腿∥锒嗍遣痪哂袚]發(fā)性的成分，而精油分離物多是揮發(fā)性成分?；ń吩腿∥锞哂休^強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌和希瓦氏菌的抑制作用最強(qiáng)，其MIC均為3.125 mg/mL，其次為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌，對(duì)大腸桿菌的抑制作用最弱?；ń吩腿∥锞哂幸欢ǖ目寡趸饔?，12.5和50 mg/mL的花椒渣萃取物對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基的清除率分別為100%和91.35%。研究表明不同的提取方式和萃取溶劑所得到的花椒油樹(shù)脂的抑菌活性和抗氧化活性具有較大的差異[26]。

本文研究表明了花椒渣萃取物包含多種活性組分，具有一定的抑菌作用和抗氧化作用，在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用開(kāi)發(fā)空間，能夠?qū)崿F(xiàn)花椒渣料資源的高值化利用。但是本文僅對(duì)花椒渣萃取物的抑菌活性和抗氧化活性做了簡(jiǎn)單探究，對(duì)其抑菌機(jī)理缺乏更加深入的探索。另外，對(duì)花椒渣料進(jìn)行超臨界CO2萃取，成本較高，對(duì)其提取和利用方式還需進(jìn)一步優(yōu)化。