高取代度酸解乙酰化淀粉及其納米顆粒的制備

翟青霖，王若冰，滕佳璐，華書嫻，陳家雯，洪 雁

（江南大學食品學院, 江蘇無錫 214122）

近年來，天然聚合物納米顆粒在生物醫(yī)學和靶向給藥系統(tǒng)方面的應用引起了廣泛關注[1]。納米顆粒是大小為10～1000 nm的固體膠體顆粒[2]，比表面積大、流動性好，在精準醫(yī)療和靶向釋放方面多有報道[3-4]。迄今為止，已研究的納米載藥體系包括納米顆粒、納米凝膠、納米乳液和納米脂質體等[5-6]。淀粉是一種含量豐富、廉價、無毒、自然可再生的生物聚合物，以淀粉為原料制備的納米顆粒具有可生物降解、生物相容性好、儲存穩(wěn)定等優(yōu)點，是良好的靶向制劑的藥物載體[7]。然而，天然淀粉易被胃腸道酶降解，且粒徑較大，極大限制了其在納米載藥體系方面的應用[6]。Gg等[8]報道稱，納米顆粒的性質受其合成方法及條件的影響，而一個受控單分散的顆粒尺寸對其在生物醫(yī)學和制藥領域的應用是至關重要的，因此要對天然淀粉進行疏水改性，并降低分子粒徑，從而改善其應用性能。

乙?；浅Ｒ姷牡矸鄹男苑椒╗9]，天然淀粉通過與醋酸酐、醋酸乙烯酯或醋酸反應，發(fā)生酯化，從而增加其疏水性[7]。不同取代度的乙?；矸劬哂胁煌睦砘再|和功能特性[10]，高取代度的乙?；矸墼诒?、氯仿等有機溶劑中具有較大的溶解度[1]，具有熱塑性、高疏水性和生物可降解性，過去常被用作工業(yè)涂層材料、熱熔粘合劑等[11]，近年來，其作為控釋載體材料的研究成為了新的熱點[12]。有報道稱[13]，隨著取代度升高，淀粉顆粒形貌更接近球形。

酸解是通過降低淀粉鏈分子量和黏度來改善淀粉功能性的常用方法[14]，酸改性淀粉的制備方法包括濕法、生物酶解二次酸化法、非水溶劑法等。其中，濕法酸解方法簡單、易控制，常與其他方法復合進行淀粉復合改性[15]，邢俊杰[16]通過酸解前處理與濕熱復合，制備得到300 nm左右的淀粉納米晶。目前，酸解預處理制備低取代度乙?；矸垡延袌蟮繹17-19]，但鮮見其在制備高取代度乙?；矸圻^程的作用研究，該方法或有利于降低空間位阻，提高乙?；矸廴〈龋绊懏a品性能。因此，研究酸解工藝條件對酸解乙?；矸劢Y構、性質的影響，對后期制備性能良好的淀粉納米顆粒具有重要意義。

本文對玉米淀粉進行酸解和乙酰化復合改性處理，探討了不同酸解條件對酸解乙?；矸劾砘再|及結構的影響，并采用反溶劑法制備淀粉納米顆粒，為構建一種可控、有效的靶向給藥系統(tǒng)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉（水分含量為13.84 g/100 g） 山東諸城興貿玉米開發(fā)有限公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、乙酸、乙酸酐、硫酸、丙酮 均為分析純，國藥集團。

SW22恒溫水浴鍋 德國JULABO公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；UN110型烘箱 美墨爾特（上海）貿易有限公司；RO 5型磁力攪拌器 德國IKA公司；RJ-LD-50G型低速立式大容量離心機 Eppendorf公司；RVA-rechmaster型快速黏度分析儀 澳大利亞Newport Scientific有限公司；DM-BA4500型光學顯微鏡 中國Motic公司；Quanta 200掃描電子顯微鏡 荷蘭Fei公司；IS10傅立葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司；D8 Advance型X-射線衍射儀 德國Bruker公司；OCA15EC型視頻光學接觸角測量儀 德國德菲儀器股份有限公司；多角度粒度與高靈敏Zeta電位分析儀 美國布魯克海文儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸解淀粉的制備 稱取75 g干基玉米淀粉分散到一定濃度的乙醇溶液中，配制成25%（w/v）的淀粉乳，再加入3 mL一定濃度的鹽酸，置于恒溫水浴鍋中，在一定溫度下反應1 h后，加入一定量 1 mol/L的Na2CO3溶液至pH=7，終止反應，冰浴5 min，抽濾，采用50%（v/v）的乙醇洗滌沉淀3次，40 ℃過夜干燥，粉碎過100目篩，得到酸解淀粉。

1.2.2 不同酸解條件對酸解淀粉性質的影響

1.2.2.1 乙醇濃度對酸解淀粉性質的影響 鹽酸濃度為12 mol/L，酸解溫度為65 ℃，乙醇濃度為50%、70%、90%，不同乙醇濃度分別命名為A50、A70、A90。

1.2.2.2 鹽酸濃度對酸解淀粉性質的影響 酸解溫度為 65 ℃，乙醇濃度為 70%，鹽酸濃度為 6、9、12 mol/L，不同鹽酸濃度分別命名為B6、B9、B12。

1.2.2.3 酸解溫度對酸解淀粉性質的影響 乙醇濃度為70%，鹽酸濃度為 12 mol/L，酸解溫度為55、65、75 ℃，不同酸解溫度分別命名為 C55、C65、C75。

1.2.3 酸解乙酰化淀粉的制備 稱取1.2.1中樣品10 g，加入30 mL乙酸和20 mL乙酸酐攪拌均勻后轉移到水浴鍋，緩慢滴加入2 mL濃硫酸作為催化劑。70 ℃下反應60 min，反應結束后，將反應體系倒入冰水中使得淀粉沉出，抽濾，并用去離子水洗滌多次，40 ℃過夜干燥，粉碎過篩得到酸解乙?；矸郛a品。取1.2.1中酸解淀粉進行乙?；幚恚―），經過預實驗得到取代度最高的組別A70B12C65D，以此為基礎結合文獻[17-19]，選擇三組常見酸解變量進行探究，得到八組酸解乙酰化淀粉，樣品分別命名為A70B12C65D、A50B12C65D、A70B12C65D、A90B12C65D、A70B6C65D、A70B9C65D、A70B12C55D、A70B12C75D。

1.2.4 納米顆粒的制備 取適量1.2.2中樣品，加入丙酮，配制成 10 mg/mL的乳液，攪拌 60 min，備用。將丙酮溶液逐滴加入到40 mL去離子水中，使納米顆粒逐漸沉出，室溫下不斷攪拌直至丙酮完全揮發(fā)，取樣保存。

1.2.5 傅里葉變換紅外（FTIR）分析 采用KBr壓片法，將1.2.1與1.2.2中樣品與溴化鉀以1:60（w/w）的比例研磨均勻，取適量樣品壓成片后用紅外光譜儀進行測試。掃描波數(shù)范圍為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，以空氣為背景繪制紅外譜圖。

1.2.6 乙?；腿〈葴y定 參考Whister等[20]的方法，并作適當修改。DS被定義為每個葡萄糖單位擁有一個取代基的平均位點數(shù)。準確稱取1.2.2中樣品1.5 g（精確至0.0001 g）于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，5 mL乙醇，2～3滴酚酞，用0.05 mol/L NaOH調節(jié)至微粉色，再加入25 mL 0.5 mol/L的NaOH，室溫下磁力攪拌1 h后，用0.2 mol/L HCl滴定至紅色褪去，記錄消耗鹽酸體積，同時，做試劑空白實驗，記錄消耗鹽酸體積。每組樣品制備三組平行，按照下列公式計算樣品的取代度：

式中：A表示乙?；|量分數(shù)，%；V0表示空白樣消耗鹽酸標準溶液的體積，mL；V1表示樣品消耗鹽酸標準溶液的體積，mL；c表示HCl標準溶液濃度，mol/L；m表示干基樣品質量，g；DS表示乙?；〈?。

1.2.7 X射線衍射（XRD） 參考魏本喜[21]的方法，并作適當修改。將1.2.1與1.2.2中樣品壓片后放置于X-衍射儀中，設定掃描角度。測試條件為：掃描范圍 5°～40°，掃描速度 0.5°/s，加速電壓 40 kV，電流20 mA，結果用MDI Jade 6.0積分計算結晶度。

1.2.8 接觸角測試 參考何君[22]的方法，并作適當修改。稱取1.2.2中淀粉樣品0.25 g，放入標準模具，經紅外壓片機壓至約0.7 mm薄片，通過高精度注射器系統(tǒng)滴加一滴2 μL的去離子水，同時通過高速相機以10幀/s的采集速度記錄水滴在薄片表明的球形變化趨勢，以OCA15EC接觸角測量儀測定固定液的接觸角。

1.2.9 糊化特性測定 參考陳夢雪等[23]的方法，并作適當修改。稱取一定質量樣品與25 g去離子水置于RVA專用鋁盒中，配制成7%（w/w）濃度的淀粉乳，混勻后采用快速黏度分析儀在標準程序下測定淀粉糊黏度的變化，得到樣品糊化曲線。

1.2.10 掃描電子顯微鏡（SEM） 參考李佳佳等[19]的方法，并作適當修改。將淀粉樣品經離子濺射儀噴金固定，于10 kV加速電壓下采用掃描電鏡觀察樣品的微觀形貌，放大倍數(shù)分別為1000和8000。

1.2.11 Zeta電位測定 取1.2.3中樣品，用去離子水制備濃度為1.0 mg/mL的溶液，使用Zeta電位分析儀測定25 ℃的Zata電位，水折射率為1.330，黏度為 0.8872 mPa·s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)為3次平行測量的平均值，實驗數(shù)據(jù)取平均值，并以平均值±標準差（±SD）表示，使用Origin 9軟件進行相關圖表繪制；并采用IBM SPSS Statistic23軟件（IBM公司，美國）中單因素方差分析（ANOVA，Duncan）進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 特征基團分析

利用淀粉顆粒的葡萄糖單元的官能團對紅外光的選擇性吸收原理，對樣品進行紅外光譜測試，從而判斷樣品的乙?；〈闆r。以原淀粉、酸解淀粉作為參照，對乙?；欠癯晒M行定性分析，紅外圖譜如圖1所示。酸解后沒有引入新的基團，但由于酸解使得淀粉分子鏈變短、聚合度降低，分子鏈上的結合水與淀粉分子的相互作用力下降，結合水減少，導致在3420 cm-1附近的O-H伸縮振動峰略有減小[24]；乙酰化改性后出現(xiàn)新的吸收峰，1750 cm-1處出現(xiàn)C=O伸縮振動峰，1435、1375 cm-1處出現(xiàn)CH3彎曲振動峰[25]，1240、1163 cm-1處出現(xiàn)C-O-C伸縮振動峰，說明各組樣品均成功引入乙酰基基團[26]。

圖1 原淀粉、酸解淀粉及不同酸解條件下酸解乙?；矸鄣募t外圖譜Fig.1 FTIR spectrum of acid-hydrolyzed starch, acid-thinned acetylated starch and native acetylated starch

2.2 不同酸解條件對取代度的影響

在乙?；^程中，淀粉分子中每個脫水葡萄糖單元上三個羥基被乙?；〈某潭燃幢硎緸槿〈萚7]。不同乙?；矸鄣娜〈热绫?所示，未經酸預處理的直接乙?；矸廴〈葹?.84，在較高濃度酸（12 mol/L）及較低溫度（55～65 ℃）的酸解預處理條件下，乙?；矸鄣娜〈染兴岣摺Ｆ渲?，鹽酸濃度的改變對乙?；矸廴〈鹊挠绊懽顬轱@著（P＜0.05） ，隨著鹽酸濃度由 6 mol/L增加至 12 mol/L，取代度由0.62增加至1.33，這是由于高濃度鹽酸能夠提高淀粉的酸解程度[27]，從而暴露更多取代位點[28]，這與唐洪波等[27]的報道結果一致。而溫度的升高并不一定能夠提高取代度，在75 ℃酸解條件下，得到的乙?；矸廴〈容^直接乙?；矸鄣停瑸?.73，這可能是由于此溫度高于淀粉的糊化溫度，導致分子間氫鍵斷裂，乙醇溶劑滲入并與淀粉緊密結合[29]，阻礙了乙?；噭┑倪M入。隨著乙醇濃度的增加，乙酰化淀粉取代度先增后減，這可能是因為高濃度醇對結晶區(qū)有保護作用[30]，從而降低了反應過程中乙?；娜〈Ч?。當乙醇濃度為70%（v/v），鹽酸濃度為12 mol/L，酸解溫度為65 ℃時，取代度達到最大，為1.33，是乙?；淖罴褩l件。乙?；鶠槭杷曰鶊F，高取代度的酸解乙?；矸凼欠慈軇┓ㄖ苽浼{米微球的良好原料。

表1 不同酸解條件處理的酸解乙酰化淀粉取代度Table 1 Degree of substitution of acid-thinned acetylated starch treated by different acidolysis conditions

2.3 結晶結構分析

原淀粉、酸解淀粉和酸解乙?；矸鄣腦射線衍射圖譜如圖2所示。由圖2A可知，酸解淀粉與原淀粉晶型相同，為典型的A型淀粉[11]，分別在15°、17°、18°和23°處有衍射峰，說明酸解沒有改變淀粉的結晶結構，這與Utrilla-Coello等[31]的報道一致。表2反映了酸解淀粉及原淀粉的結晶度。由圖2A和表2可知，酸解后淀粉的結晶區(qū)增加，結晶度更顯著（P＜0.05） ，這是由于酸解過程優(yōu)先發(fā)生于非結晶區(qū)[32]，從而使得結晶區(qū)相對比例增加。

圖2 原淀粉、酸解淀粉（A）及乙?；矸郏˙）的XRD圖譜Fig.2 XRD patterns for native starch, acid-hydrolyzed starch(A) and acetylated starch (B)

表2 不同酸解淀粉的結晶度Table 2 Crystallinity of different acid-hydrolyzed starches

由圖2B可知，酸解淀粉經乙?；男院?，原來的A型衍射峰全部消失，在9°和21°左右出現(xiàn)了兩個寬峰，為典型的無定形圖案[11]。淀粉高度有序的結晶結構由分子內和分子間氫鍵構成[1]，乙?；囊胂魅趿藲滏I的形成，并導致原雙螺旋結構被破壞[12]；但在取代度未達到一定大小的情況下，部分未被取代的羥基仍能形成氫鍵，因此存在強度較弱的晶體峰。與直接乙?；矸巯啾龋峤庖阴；矸墼?°和21°處的峰更突出，這是因為酸解過程將單個雙螺旋從支鏈淀粉分離，消除了空間限制，從而允許雙螺旋重排，形成更多的晶體結構[28]。與結晶區(qū)相比，無定形區(qū)結構疏松，具有較高滲透性，化學活性較高[33]，有利于后續(xù)納米顆粒的制備。

2.4 接觸角分析

接觸角可以體現(xiàn)樣品的疏水程度，接觸角越大則樣品疏水性越強[34]。酸解淀粉和原淀粉親水性極強，無法測定其水接觸角。不同酸解條件乙酰化淀粉的水接觸角如表3所示，乙?；矸劢佑|角為50°～60°。結合表2和表3可知，隨酸解乙?；矸廴〈鹊脑黾?，接觸角不斷增大，即疏水性提高。這可能是因為乙?；矸弁ㄟ^在淀粉分子中引入疏水性基團乙?；?，使部分羥基結構被破壞，進而破壞了氫鍵作用[35]，使其接觸角隨取代度的增大而顯示增加趨勢。由于本文所用的乙?；瘶悠啡〈雀撸适杷韵啾仍矸鄹鼜?，更有利于提高其在良溶劑丙酮溶液中的分散度，以制備粒徑更小的淀粉納米顆粒。

表3 不同酸解乙酰化淀粉的接觸角Table 3 Contact angle of different acetylated acid hydrolysis modified starch

2.5 糊化特征值

酸處理可以降低淀粉分子量，從而影響淀粉的糊化特征值[16,36]。乙?；矸凼杷暂^強，在水溶液中分散性差，難以測定糊化特征值。不同酸解淀粉的糊化特征值如表4所示，酸處理可以使玉米淀粉的糊化黏度顯著下降（P＜0.05） ，這可能是由于淀粉吸水膨脹主要發(fā)生在無定型區(qū)，酸進入無定型區(qū)，水解其中的糖苷鍵，使淀粉顆粒結構減弱，限制淀粉吸水膨脹，大幅度降低淀粉糊化黏度[16,37]。乙?；矸廴芙舛炔?，不能使用該方法測定其糊化曲線。隨著乙醇濃度的增加，酸解淀粉的峰值黏度不斷降低，最低黏度、最終黏度、崩解值、回生值均隨乙醇濃度的增加而下降，這是由于乙醇的脫水作用能夠抑制由淀粉顆粒吸水過多導致的顆粒膨脹，隨著乙醇濃度增加，脫水作用增強，酸進入到較少膨脹的無定形區(qū)，使淀粉顆粒結構變弱，淀粉的黏度因此下降[38]。隨著反應溫度的升高，酸解淀粉的峰值黏度顯著降低，最低黏度等值均顯著下降，當反應溫度達到75 ℃時，淀粉的黏度較小，這是由于溫度高于淀粉糊化溫度時，淀粉分子間氫鍵斷裂，進一步加強了酸對淀粉的水解作用。相較于原淀粉，鹽酸濃度的改變對酸解淀粉糊化黏度不構成顯著影響，這可能是由于淀粉分子的聚合度在較低鹽酸濃度下已降低至一定程度，使其黏度降低趨緩[39]。較低的糊化黏度也反映了較小的淀粉粒徑，有利于制備粒徑更小的淀粉納米顆粒。

表4 不同酸解淀粉的糊化特征值Table 4 Gelatinization characteristic values of different acid-hydrolyzed starches

2.6 掃描電子顯微鏡觀察結果分析

為了比較乙酰化改性對酸解淀粉顆粒形態(tài)及大小的影響，對酸解淀粉乙酰化改性前后的形態(tài)特征進行掃描電鏡觀察。由于多組酸解乙?；矸鄣膾呙桦婄R顆粒大小、形狀基本相同，現(xiàn)以取代度相差較大的三組酸解乙?；矸蹣悠放c其酸解淀粉進行對比分析。由圖3可知,酸解淀粉乙酰化處理后顆粒變小，團聚現(xiàn)象出現(xiàn)，且取代度越高，得到的淀粉顆粒粒徑越低，顆粒形貌越好[13]。

由圖3可知，酸解淀粉顆粒飽滿，為形狀不規(guī)則的多面體，棱角分明，粒徑大小相似，粒徑范圍約為60～260 μm。結合表5可知，酸解程度越大，淀粉顆粒表面有腐蝕和損傷現(xiàn)象越明顯[40]，這表明這些酸解淀粉表面結晶結構被破壞[41]。酸解淀粉經乙?；纸鉃椴痪鶆虻牟灰?guī)則形狀，粒徑范圍約為10～50 μm，且隨著取代度的提高，淀粉顆粒明顯減小且粒徑分布變窄，同時出現(xiàn)團聚現(xiàn)象。這可能是因為淀粉顆粒減小會導致表面活化能升高[42]，有利于發(fā)生分子間聚集。隨取代度的提高，淀粉上的羥基逐漸被疏水性乙?；〈?，分子間氫鍵減少，疏水締合能力增強[43]。結合郭春香[7]的研究，高取代度乙?；矸墼诓涣既軇┲袛U散相對均勻，與低取代度乙?；矸巯啾?，其成球性好且淀粉納米微球大小均勻。

圖3 淀粉顆粒形貌在不同條件下的電鏡掃描圖Fig.3 SEM of starch granule morphology under different conditions

2.7 淀粉納米顆粒粒徑

反溶劑法是利用溶解于良溶劑的聚合物在與不良溶劑接觸時受到的擠壓作用制備納米顆粒的方法[44]。不同取代度的乙酰化淀粉納米顆粒粒徑分布如表5所示。表5分別是取代度0.69、0.86、1.33的酸解乙酰化淀粉及取代度0.84的直接乙?；矸弁ㄟ^反溶劑法制備出的淀粉納米的粒徑分布圖。酸解乙?；{米淀粉的平均粒徑明顯減小，分別為271.43、189.25、121.56 nm，且粒徑分布較集中。以上結果說明，該納米顆粒制備方法對不同取代度的酸解乙?；矸鄱加休^好的效果。原淀粉微球粒徑過大（微米級，49.52599±3.20600 μm），討論價值不高，故不再進行分析。

表5 不同取代度的乙?；矸奂{米顆粒粒徑分布Table 5 Particle diameter distributions of acetylated starch nanoparticles with different degree of substitution

由表5可知，相比直接乙?；矸壑苽涞牡矸奂{米顆粒，酸解乙?；{米淀粉的平均粒徑明顯減小，這說明酸解預處理可以通過降低淀粉樣品分子量并改變淀粉分子表面和內部的一些屬性，顯著降低淀粉納米顆粒粒徑，這與李令金[45]的報道一致。同時，酸解乙?；矸廴〈葘{米顆粒的粒徑產生了顯著影響，結合表5取代度數(shù)據(jù)分析可知，取代度更高的組別納米顆粒粒徑更小，這可能是因為取代度增加有利于提高乙?；矸墼诹既軇┍芤褐械姆稚⑿訹1]，從而制備粒徑更小的淀粉納米顆粒。結合前人報道[43,46]，酸預處理可以通過降低淀粉分子量和提高酸解乙?；矸鄣娜〈龋档鸵阴；{米淀粉顆粒的粒徑。

3 結論

本文探討了不同酸解預處理條件對淀粉乙?；〈纫约凹{米顆粒粒徑大小的影響。對不同條件的酸解樣品進行乙?；幚砗?，發(fā)現(xiàn)以乙醇濃度70%、鹽酸濃度12 mol/L、溫度65 ℃的酸解條件預處理乙酰化淀粉的取代度及接觸角最大，達到1.33，相較直接乙?；矸鄣玫矫黠@提高，進一步證明酸解預處理能夠增大乙?；〈?，從而使疏水性提高。此外，對結晶結構和微觀形貌的分析表明，酸解對淀粉表面結構的初步破壞能夠幫助淀粉在乙?；蟮玫降牡矸垲w粒粒徑進一步減小。用反沉淀法制備微球并表征其粒徑，納米顆粒粒徑最低可達121.56，相對直接乙?；矸埏@著降低（P＜0.05）。綜上所述，適當強度的酸解預處理能夠有效增加淀粉的乙酰化改性程度，減小淀粉納米顆粒的粒徑。在本文條件下，乙醇濃度70%、鹽酸濃度12 mol/L、溫度65 ℃的酸解條件處理效果對后續(xù)改性的影響最明顯，但酸解程度與乙酰化程度并非呈線性相關性，其中的機理還有待進一步的探索討論。本文的研究結果為淀粉基納米載體在生物醫(yī)藥等領域的應用提供了理論基礎。