鐵皮石斛花總黃酮的綠色提取工藝優(yōu)化

邵 寧，刁洪林，王 薛，賀增洋，姜余婷，韓 偉，王國(guó)凱，鄒 鵬,

（1.安徽中煙工業(yè)有限公司技術(shù)中心, 安徽合肥 230088；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 安徽合肥 230012）

鐵皮石斛（Dendrobium officinal），為蘭科石斛屬草本植物，因其表皮為鐵綠色得名。其主要分布在中國(guó)西南部，如安徽、浙江、福建等地，喜陰涼濕潤(rùn)，好高山巖石[1]。鐵皮石斛含有多糖、石斛堿、黃酮類(lèi)、菲類(lèi)、微量元素、氨基酸等多種成分，所以具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤活性等功效，被列入《中華人民共和國(guó)藥典》[2-3]。傳統(tǒng)鐵皮石斛制品主要以莖為原料加工而成，其鮮花和干花未能得到充分利用而造成極大浪費(fèi)[4]。研究表明鐵皮石斛的莖、葉、花的成分相似，僅在含量上有所區(qū)別[5]，所以鐵皮石斛的花、葉同樣具有藥用功效。研究顯示鐵皮石斛花中多糖、生物堿、氨基酸含量相對(duì)較低，但黃酮類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)含量高于莖和葉，而該類(lèi)物質(zhì)具有天然的抗氧化、抗衰老作用[6]。

黃酮類(lèi)成分的傳統(tǒng)提取方法主要使用有機(jī)溶劑，此方法存在提取效率低、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)[7]。Abbott等[8]于2003年所報(bào)道的DESs是一種新型綠色溶劑，有著類(lèi)似離子液體的性質(zhì)，具有良好的生物兼容性、安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于多糖類(lèi)[9]、生物堿[10]、酚酸類(lèi)[11]等生物活性成分的提取。DESs是由一定化學(xué)計(jì)量比的季銨鹽、季膦鹽等氫鍵受體（Hydrogen bond acceptor, HBA）和醇、酰胺等氫鍵供體（Hydrogen bond donors, HBD），通過(guò)分子間氫鍵作用組合而成的低熔點(diǎn)混合物[12]。其中以氯化膽堿為HBD的DESs制備簡(jiǎn)單、性質(zhì)穩(wěn)定，應(yīng)用較為廣泛[13]。目前，已有許多研究關(guān)注DESs用于提取天然植物如桂花[14]、甘草[15]、臘菊[16]中的多種化合物。而將DESs和響應(yīng)面法結(jié)合用于鐵皮石斛花黃酮的研究還十分有限。因此，研究出一種綠色高效的方法來(lái)提取鐵皮石斛花中的黃酮類(lèi)物質(zhì)是十分必要的。

為研究鐵皮石斛花黃酮的綠色提取工藝，本研究采用篩選組分后的DESs作為提取介質(zhì)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合BBD設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法，建立模型指導(dǎo)提取工藝，優(yōu)化得到總黃酮的最佳工藝條件，實(shí)現(xiàn)高效提??；另外使用大孔樹(shù)脂吸附法回收黃酮和DESs，重復(fù)利用溶劑以評(píng)價(jià)該方法的綠色可持續(xù)性，實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛花的綠色提取。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛干花（霍山） 由皖西學(xué)院提供，經(jīng)鑒定為蘭科植物鐵皮石斛的花；氯化膽堿（98%）、乙二醇（99%）、1，2-丙二醇（99%）、丙三醇（99%）、尿素（AR）、乳酸（99 %）、氫氧化鈉（AR）、亞硝酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（98%）、無(wú)水乙醇（AR）、二甲基硅油 H201-100（AR） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大孔吸附樹(shù)脂NAK-9、D101、AB-8鄭州新和成材料科技有限公司。

UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；80-2電動(dòng)離心機(jī) 常州普天儀器制造有限公司；AL204-IC電子天平 梅特勒托利多國(guó)際有限公司；PPS2511-CE平行合成儀 日本東京理化公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DESs溶劑制備 本文采取氯化膽堿為HBA、乙二醇、1，2-丙二醇、丙三醇、尿素、乳酸等作為HBD制作DESs。將HBA、HBD置于圓底燒瓶中，在80 ℃油浴中加熱攪拌，直至形成均一透明的液體[17]。改變 HBA 和 HBD 的摩爾比（1:2、1:3、1:4、1:5），考察不同組成的DESs溶劑對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.2 鐵皮石斛花總黃酮的提取 將鐵皮石斛干花在40 ℃下烘干2 h至恒定質(zhì)量，粉碎過(guò)80目篩備用。準(zhǔn)確稱(chēng)量干花粉末0.8 g置于試驗(yàn)管中，加入DESs浸泡混合均勻后放入平行反應(yīng)器，根據(jù)設(shè)計(jì)的溫度、時(shí)間進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，之后冷卻至室溫，加入對(duì)應(yīng)組成的DESs溶劑補(bǔ)足質(zhì)量至與提取前相同，將提取液轉(zhuǎn)移至離心管，3000 r/min下離心30 min，取上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜得到黃酮提取液[18]。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 采用得率最高的DESs作為溶劑，考察不同提取條件對(duì)總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)四個(gè)因素，包括DESs含水量X1（0%、20%、40%、60%、80%；50 ℃，20:1 mL/g，30 min），提取溫度X2（40、50、60、70、80、90、100 ℃；20%，20:1 mL/g，30 min），液固比 X3（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 mL/g；20%，90 ℃，30 min），提取時(shí)間 X4（10、20、30、40、50 min；20%，90 ℃，20:1 mL/g）。對(duì) 4 個(gè)因素選擇各自最佳水平進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Design Expert 12.0.3.0軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以總黃酮得率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見(jiàn)表1。

表1 BBD實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 BBD experiment design of factor and level

1.2.5 總黃酮得率的測(cè)定[19]采用 NaNO2-Al（NO3）3分光光度法測(cè)定總黃酮，稱(chēng)取干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品30.0 mg，無(wú)水乙醇溶解定容于10 mL容量瓶，得到3.0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 上述溶液至 10 mL容量瓶，稀釋至5 mL，加入0.5 mL的0.05 g/mL亞硝酸鈉，搖勻放置6 min，再加入0.5 mL的（0.1 g/mL）硝酸鋁，再搖勻放置6 min，再加入4 mL的0.04 g/mL氫氧化鈉并定容至10 mL，搖勻放置5 min。過(guò)微孔膜過(guò)并于510 nm處測(cè)量吸光度，測(cè)量三次。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=10.74857X-0.0416，R2=0.9993，表明蘆丁在0.03～0.18 mg/mL呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。樣品總黃酮的測(cè)定：取樣品溶液0.2 mL按照上述方法顯色測(cè)量得到吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到對(duì)應(yīng)總黃酮濃度，得率計(jì)算公式如下：

式中：Y表示鐵皮石斛總黃酮得率，mg/g；c表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；D表示溶液稀釋倍數(shù)；V表示供試品溶液體積，mL；m表示取樣量，g。

1.2.6 總黃酮回收和DESs循環(huán)利用 采用AB-8、ADS-8、D101三種大孔樹(shù)脂進(jìn)行總黃酮回收實(shí)驗(yàn)。取最優(yōu)條件下的總黃酮提取液4 mL，分別加入大孔樹(shù)脂0.75和1.50 g，在25 ℃下置于搖床上振蕩12 h（100 r/min），取其上清液測(cè)定吸附率。針對(duì)最佳吸附率的樹(shù)脂進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。濾液DESs再次用于鐵皮石斛花樣品提取，測(cè)量并計(jì)算重復(fù)利用率。過(guò)濾得到大孔樹(shù)脂置于30 mL甲醇中解吸附6 h（25 ℃，100 r/min），取解吸液測(cè)定解吸率。相關(guān)計(jì)算公式如下：

式中：c0、c1、c2分別為提取液、吸附平衡液、解吸平衡液的總黃酮濃度，mg/mL；V0、V2分別為提取液、解吸平衡液的體積，mL；Y1、Y2分別為初次得率和二次得率，mg/g；A、D、R分別為吸附率、解吸率、重復(fù)利用率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design Expert 12.0.3.0軟件處理，采用方差分析進(jìn)行多重比較。模型的擬合度參考回歸系數(shù)R2，R2越接近1表示模型越準(zhǔn)確，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 DESs組成對(duì)總黃酮得率的影響

不同氫鍵供體與氯化膽堿形成的DESs間的溶解性、黏度、表面張力差異，對(duì)于黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取效率有著重要影響[20]。為選擇最優(yōu)的低共熔溶劑，在固定提取溫度（50 ℃）、時(shí)間（30 min）、液固比（20:1 mL/g）的前提下，比較了常見(jiàn)的5種DESs在不同摩爾比下的得率。結(jié)果如表2所示，比較不同氫鍵供體可以發(fā)現(xiàn)，氯化膽堿-乳酸DESs總黃酮得率低于其他，這是由于黃酮化合物主要是通過(guò)與溶劑形成分子間氫鍵來(lái)促進(jìn)溶解的[21]，而C=O電負(fù)性較大與多苯環(huán)結(jié)構(gòu)的黃酮化合物產(chǎn)生排斥影響氫鍵穩(wěn)定性。另外，-O-H-O-氫鍵強(qiáng)度高于-N-H-N-，所以多元醇DESs的得率高于尿素。然而丙三醇DESs黏度較大，使黃酮化合物擴(kuò)散阻力增大，所以得率也較低。乙二醇和1,2-丙二醇DESs得率隨著摩爾比先增高后降低，并在1:4時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)氯化膽堿：乙二醇為1:4時(shí)，得率達(dá)到13.757 mg/g，高于其他DESs，因此選擇氯化膽堿-乙二醇（1:4）作為最優(yōu)的DESs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同DESs對(duì)鐵皮石斛總黃酮得率的影響Table 2 Yield of total flavonoids of Dendrobium officinale by different DESs

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 不同含水量DESs對(duì)得率的影響 通過(guò)含水量可以調(diào)節(jié)DESs的極性、黏度，進(jìn)而影響黃酮化合物的溶解性[22]。如圖1所示，總黃酮得率隨水比例先升高至14.786 mg/g（20%）后逐漸降低至11.685 mg/g（80%）。這是由于少量的水能夠起到降低DES黏度，增大極性的作用，促進(jìn)黃酮化合物的溶解。而極性過(guò)大也不利于黃酮溶解。所以選擇20% DESs含水量作為最佳水平。

圖1 不同含水量DESs的總黃酮得率Fig.1 Total flavonoids yield of DESs with different water contents

2.2.2 不同提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 增加DESs溫度能夠降低其黏度，從而促進(jìn)溶質(zhì)擴(kuò)散[23]。結(jié)果如圖2所示，在40～70 ℃總黃酮得率緩慢上升，70～90 ℃迅速上升至17.360 mg/g，隨后逐漸下降。原因可能是低于70 ℃時(shí)，DESs與黃酮化合物氫鍵結(jié)合較弱，不利于黃酮化合物的溶出，而90 ℃以上的高溫則會(huì)使黃酮化合物的穩(wěn)定性降低。因此選擇90 ℃作為最佳提取溫度。

圖2 不同溫度下DESs的總黃酮得率Fig.2 Total flavonoids yield of DESs at different temperatures

2.2.3 不同液固比對(duì)總黃酮得率的影響 增大DESs用量使得樣品周?chē)狞S酮濃度能夠快速降低，從而始終保持較大的濃度差，有利于黃酮物質(zhì)的溶出。結(jié)果如圖3所示，得率隨著液固比增大而迅速增加。當(dāng)達(dá)到20:1 mL/g時(shí)，得率增加量較少，在30:1 mL/g時(shí)達(dá)到最大值17.538 mg/g。之后再增加溶劑，得率變化不大甚至有所降低，因此從節(jié)約溶劑角度考慮，選擇液固比為20:1 mL/g為最佳水平較為合適。

圖3 不同液固比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratios on the total flavonoids yield

2.2.4 不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 如圖4所示，鐵皮石斛花總黃酮得率隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增大，并在40 min達(dá)到最大值；當(dāng)時(shí)間超過(guò)40 min后，得率呈現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì)。這是由于初期隨著反應(yīng)進(jìn)行，黃酮化合物充分溶出并達(dá)到平衡，而提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致黃酮化合物與其他物質(zhì)反應(yīng)，或者黃酮本身穩(wěn)定性降低，使得率降低。因此選擇40 min作為最佳提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 模型建立及方差分析 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用BBD設(shè)計(jì)方法，包括4個(gè)因素、3個(gè)水平和5個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)評(píng)估模型穩(wěn)定性。試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件及結(jié)果如表3所示。通過(guò)對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得到表4中的模型方差分析結(jié)果。分析得到的回歸方程為：

表3 BBD設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果Table 3 Result of BBD design experiment

由表4的方差分析可知，所得模型極顯著（F=29.75，P＜0.0001），失擬度極不顯著（F=0.46，P＞0.5），表明該模型回歸極為顯著。R2=0.9875，RAdj2=0.9650，說(shuō)明鐵皮石斛花總黃酮得率的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值有良好擬合度，具有較好的回歸性。精密度17.9749＞4進(jìn)一步體現(xiàn)模型的準(zhǔn)確性。比較各個(gè)因素F值、P值可以看出，其對(duì)于總黃酮得率的影響順序?yàn)閄3＞X2＞X1＞X4。DESs含水量（X1）、提取溫度（X2）、液固比（X3）對(duì)總黃酮提取工藝的影響極顯著（P＜0.01），提取時(shí)間（X4）的影響顯著（P＜0.05）；提取溫度、液固比交互項(xiàng)對(duì)于響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），其他交互項(xiàng)均不顯著；平方項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Regression model analysis of variance

2.3.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面的三維等高線(xiàn)圖可以反映兩因素之間的交互作用，曲面越傾斜則表明兩者交互作用越顯著。X1、X2、X3、X4對(duì)鐵皮石斛花總黃酮得率的影響如圖5所示，可以看出液固比分別與提取溫度、時(shí)間的交互作用較強(qiáng)，這與方差分析中X2X3、X3X4兩項(xiàng)P值較低相符。根據(jù)擬合方程和方差分析結(jié)果得到的最優(yōu)提取條件為：X1=18.9%，X2=88.2 ℃，X3=23.3:1 mL/g，X4=38.0 min，預(yù)測(cè)得率為23.152 mg/g。為檢驗(yàn)該模型的準(zhǔn)確程度，在最優(yōu)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到的總黃酮得率實(shí)測(cè)值為（22.457±0.412） mg/g，表明該模型準(zhǔn)確，對(duì)鐵皮石斛花總黃酮的提取工藝優(yōu)化具有指導(dǎo)意義。

圖5 各因素交互作用對(duì)總黃酮得率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph of the of the interaction of various factors on the yield of total flavonoids

2.4 總黃酮的回收和DESs循環(huán)利用

DESs的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)就是便于重復(fù)利用。目前主要使用超臨界CO2萃取[24]、固相萃取[25]、色譜[26]等方法回收提取物來(lái)再生溶劑，此類(lèi)方法成本較高且操作復(fù)雜。而大孔樹(shù)脂吸附法被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)便而高效的方法，被普遍用于回收DESs[27-28]。本研究采用AB-8、ADS-8、D101三種不同類(lèi)型大孔樹(shù)脂來(lái)吸附DESs中的黃酮成分，來(lái)研究黃酮成分的回收和DESs的重復(fù)利用性能，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，三種樹(shù)脂吸附率均較好，且隨著樹(shù)脂用量增加，吸附效果越好。在相同吸附劑用量條件下，吸附效果順序?yàn)?ADS-8＞D101＞AB-8，其中 ADS-8在用量為1.5 g時(shí)，吸附率達(dá)到78.32%。另外，采用甲醇對(duì)吸附飽和的ADS-8進(jìn)行解吸附，解吸附率為83.55%。

圖6 不同類(lèi)型樹(shù)脂對(duì)DESs中總黃酮吸附率的影響Fig.6 Adsorption rate of different resins for total flavonoids in DESs

DESs經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂吸附后，可循環(huán)利用。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下ADS-8吸附后的DESs再次用于提取鐵皮石斛花總黃酮時(shí)，其得率為（16.792±0.434） mg/g，扣除吸附不完全帶來(lái)的背景影響，其回收利用率達(dá)到95.47%。因此，DESs使用大孔吸附樹(shù)脂回收后，性質(zhì)穩(wěn)定溶解性保持較好，可重復(fù)利用，是一種綠色優(yōu)良的提取溶劑。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的鐵皮石斛花總黃酮提取主要使用乙醇[29-30]作為溶劑。由表5可以看出傳統(tǒng)提取方法的提取效果均低于本文中DESs最佳得率（22.457 mg/g）。并且DESs提取步驟更為簡(jiǎn)便，所用溶劑量少，對(duì)環(huán)境污染小，所以DESs提取鐵皮石斛花黃酮是一種高效而綠色的提取工藝，能充分利用鐵皮石斛中的有效成分。

表5 不同提取方法對(duì)鐵皮石斛花黃酮得率Table 5 Yield of flavonoids from Dendrobium officinale flowers by different methods

3 結(jié)論

本文研究了鐵皮石斛花總黃酮的綠色DESs提取工藝。比較溶劑組成發(fā)現(xiàn)最佳溶劑組成為氯化膽堿和乙二醇（1:4），氫鍵類(lèi)型和HBD官能團(tuán)對(duì)總黃酮得率有重要影響。使用BBD-RSM方法建立的模型R2=0.9875，優(yōu)化得到的最佳條件為：DESs含水量18.9%，提取溫度88.2 ℃，液固比23.3:1 mL/g，提取時(shí)間38.0 min，預(yù)測(cè)得率為23.152 mg/g，實(shí)際得率22.457 mg/g，模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠。大孔樹(shù)脂ADS-8處理后的DESs對(duì)總黃酮仍具有較高的得率，回收利用率達(dá)95.47%。與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，該方法更加高效且綠色，溶劑實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，是一種具有工業(yè)應(yīng)用前景的提取工藝。該研究對(duì)鐵皮石斛活性物質(zhì)的綠色提取具有指導(dǎo)意義，為深入開(kāi)發(fā)新型鐵皮石斛制品提供一定的理論基礎(chǔ)。