沙棘葉多糖的提取優(yōu)化及對(duì)CT-26細(xì)胞增殖的影響

胡盼盼

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系, 山西呂梁 033000）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）是藥食同源的植物之一[1]，屬于胡頹子科沙棘屬喬木或灌木，在我國(guó)沙棘資源占世界沙棘資源的90%以上[2]，多個(gè)地區(qū)均有分布，因此我國(guó)有“沙棘王國(guó)”之稱[3]。目前沙棘的應(yīng)用主要集中在沙棘果實(shí)[4]，沙棘葉的研究較少，還未得到有效的開發(fā)和利用[5]。許多研究表明沙棘葉和沙棘果一樣富含豐富的黃酮[6]、多糖[7]等化合物，具有抗突變、抗菌、抗氧化等生物活性，并且沙棘葉產(chǎn)量大、易收集、容易貯藏。因此，研究沙棘葉多糖的提取工藝及其生物活性具有重要的實(shí)際意義。

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer）是主要發(fā)生在結(jié)腸和直腸中的一種發(fā)病率和死亡率都較高的惡性腫瘤[8]，具有高復(fù)發(fā)率及高轉(zhuǎn)移率等的特征[9-10]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)其死亡率位于第二位，發(fā)病率位于全球癌癥的第三位[11]。目前針對(duì)結(jié)腸癌的治療手段主要手術(shù)及化療，但會(huì)對(duì)患者造成巨大痛苦，因此尋找一種能抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生，提高患者生存質(zhì)量和減少患者痛苦的天然物質(zhì)成為迫在眉睫需要解決的問題[12]。植物多糖被證實(shí)具有抗腫瘤活性，如Liang等[13]從靈芝提取得到多糖GLPs，研究表明GLPs可以顯著的增加LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞caspas-3,-8,-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Mao等[14]研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖（LBP）對(duì)SW480細(xì)胞和Caco-2均具有顯著的抑制作用，并通過G0/G1細(xì)胞周期的阻滯發(fā)揮促凋亡作用。陳貴娥等[15]研究發(fā)現(xiàn)蘋果多糖可以有效地抑制SW-620結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與遷移，濃度依賴性地上調(diào)E-cadherin、下調(diào)N-cadherin的蛋白表達(dá)來發(fā)揮抑制作用。本論文采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化呂梁沙棘葉多糖提取工藝，并分析其對(duì)結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的抑制作用，旨在為將來對(duì)沙棘葉多糖的結(jié)構(gòu)解析以及生物活性的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)，為綜合開發(fā)利用呂梁市沙棘資源提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘葉 于每年九月份采摘自呂梁汾陽市城子藥材種植有限公司；結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞 通派上海生物科技有限公司；苯酚、濃硫酸、無水乙醇 均為分析純，河南東科化工產(chǎn)品銷售有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基 Hyclone公司；PBS、DMSO、胰酶、戊二醛、胎牛血清、雙抗、PI染液 上海碧云天生物有限公司。

VS-502FD型凍干機(jī) 河南海克爾儀器儀表有限公司；BPN-50CHUV型細(xì)胞培養(yǎng)箱 濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；InfiniteM200型酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；S-1-150S型高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；CT115C型滅菌鍋 姜堰市新康醫(yī)療器有限公司；KQ2200B型超聲波儀 上海儀天科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘葉多糖提取工藝 采用超聲波波輔助提取沙棘葉多糖。采摘形狀完整、顏色均勻的新鮮沙棘葉到實(shí)驗(yàn)室，充分清洗干凈后，放入50 ℃的恒溫干燥箱干燥后粉碎，過30目篩。取沙棘葉粉100 g，加入500 mL水，超聲波波萃取后進(jìn)行濃縮，采用Sevag法去除蛋白，加入95%無水乙醇進(jìn)行醇沉，離心得到沉淀，加入蒸餾水，采用苯酚-硫酸法[7]（y=0.0531x-0.0029，R2=0.9987）測(cè)定沙棘葉多糖的得率，冷凍干燥得到沙棘葉粗多糖，最后取一定量的粗多糖配制成多糖溶液來測(cè)定其純度。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 超聲波功率為300 W、超聲波時(shí)間為20 min，超聲波次數(shù)為1次時(shí)，選取60、70、80、90 ℃研究超聲波溫度對(duì)多糖得率的影響；超聲波溫度為80 ℃、超聲波時(shí)間為20 min，超聲波次數(shù)為1次時(shí)，選取200、300、400、500 W研究超聲波功率對(duì)多糖得率的影響；超聲波溫度為80 ℃、超聲波功率為400 W、超聲波次數(shù)為1次時(shí)，選取10、20、30、40 min研究超聲波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響；超聲波溫度為80 ℃、超聲波功率為400 W、超聲波時(shí)間為30 min時(shí)，選取1、2、3、4次研究超聲波次數(shù)對(duì)多糖得率的影響。

1.2.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，4個(gè)因素：超聲波溫度（A）、超聲波功率（B）、超聲波時(shí)間（C）、超聲波次數(shù)（D）各選擇3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以多糖得率為試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了L9（34）的正交試驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal experimental factors

1.2.4 MTT試驗(yàn) 待CT-26細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后消化收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/mL，每孔100 μL加入96孔板。將終濃度為0、250、500、1000、2000、2500 μg/mL的沙棘葉粗多糖加入96孔板中，各設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)72 h后倒走舊液，加入PBS清洗兩遍，然后每孔中加入100 μL的0.5 mg/mL MTT，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)4 h，倒走M(jìn)TT后每孔中加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min后用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算細(xì)胞活力[16]。

1.2.5 透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài) CT-26細(xì)胞經(jīng)過沙棘葉多糖處理72 h后，胰酶消化后收集細(xì)胞至1.5 mL離心管，使用預(yù)冷PBS清洗兩次，加入戊二醛，4 ℃溫度下靜置過夜，之后PBS清洗兩次，之后交至哈爾濱醫(yī)科大學(xué)電鏡中心進(jìn)行后續(xù)透射電鏡實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 細(xì)胞周期測(cè)定 將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔2 mL。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后加入終濃度為 2000 μg/mL的沙棘葉粗多糖，培養(yǎng)72 h后，胰酶消化細(xì)胞，和上清液中合并后離心（1000 r/min，5 min）；用 4 ℃ 預(yù)冷 PBS 清洗三次后加入-20 ℃預(yù)冷的70%的乙醇1 mL，放于4 ℃過夜固定；離心后倒掉固定液，PBS清洗兩次，離心后加入0.5 mL 的PI染液（含100 μg/mL RnaseA，100 μg/mL，0.2%Triton X-100），在避光環(huán)境下反應(yīng)30 min之后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.2.7 反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR） 經(jīng)過2000 μg/mL的沙棘葉粗多糖處理CT-26細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，根據(jù)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，采用RT-PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.8 Western blot 經(jīng)過 2000 μg/mL的沙棘葉多糖處理CT-26細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉后孵育一抗，洗膜三次后孵育二抗，最后加入發(fā)光液進(jìn)行曝光，并對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)都重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行one-way ANOVA分析并作圖，P＜0.05表示數(shù)據(jù)之間差異顯著。不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波溫度對(duì)沙棘葉多糖得率的影響

超聲波溫度對(duì)沙棘葉多糖得率的影響見圖1，溫度對(duì)沙棘葉多糖的得率具有一定影響。由圖1可知，超聲波溫度在60 ℃時(shí)，多糖的得率較低，隨著超聲波溫度的增加，多糖得率也不斷增大，在80 ℃時(shí)，沙棘葉多糖得率最大（P＜0.05），這可能是由于隨著溫度不斷升高，沙棘葉溶解度升高，提取較為充分。因此正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)超聲波溫度為70～90 ℃。

圖1 超聲波溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharide yield

2.2 超聲波功率對(duì)沙棘多糖得率的影響

超聲波功率對(duì)沙棘葉多糖得率的影響見圖2。由結(jié)果可知，沙棘葉多糖的得率隨著超聲波功率的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。超聲波功率為200 W時(shí)，多糖得率僅有4%；在400 W時(shí)，沙棘葉多糖的得率達(dá)到最大，顯著高于其他功率組（P＜0.05），之后得率反而減少，這可能是由于在一定功率范圍內(nèi)有利于細(xì)胞的破壁，而功率過大過小均可能由于破壁不充分或破壞多糖結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致多糖得率的減少[17]。因此設(shè)定超聲波功率為300～500 W。

圖2 超聲波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.3 超聲波時(shí)間對(duì)沙棘多糖得率的影響

超聲波時(shí)間對(duì)沙棘葉多糖得率的影響見圖3。由結(jié)果可知，超聲波時(shí)間能夠明顯影響沙棘葉多糖的得率。處理時(shí)間20 min時(shí)，沙棘多糖得率最低，隨著超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)，沙棘葉多糖得率不斷增加，超聲波30 min的時(shí)候，多糖得率達(dá)到最大（P＜0.05），并且繼續(xù)延長(zhǎng)超聲波的時(shí)間，對(duì)多糖得率影響較小。這可能是由于超聲波處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞壁的破碎程度越大，沙棘葉多糖得率也就越高，但是達(dá)到一定處理時(shí)間后，溶液滲透壓達(dá)到平衡狀態(tài)，多糖得率趨于平穩(wěn)不再增加[18-19]。因此設(shè)定超聲波時(shí)間為20～40 min。

圖3 超聲波時(shí)間對(duì)-多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield

2.4 超聲波次數(shù)對(duì)多糖得率的影響

超聲波次數(shù)對(duì)沙棘葉多糖得率的影響見圖4。結(jié)果可知，超聲波處理一次后，沙棘葉多糖得率為6.31%，超聲波處理兩次后，多糖得率最大，顯著高于提取 1、3、4 次組（P＜0.05），但繼續(xù)增加超聲波次數(shù)，多糖得率沒有明顯的增加。因此設(shè)定超聲波次數(shù)為1～3次。

圖4 超聲波次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on polysaccharide yield

2.5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了沙棘葉多糖提取工藝的正交優(yōu)化。由表2可知，影響沙棘葉多糖得率的因素大小排序是：B（超聲波功率）＞C（超聲波時(shí)間）＞A（超聲波溫度）＞D（超聲波次數(shù)），最佳提取工藝是A1B2C2D2，即超聲波溫度是70 ℃、超聲波功率是400 W，超聲波時(shí)間為30 min，超聲波次數(shù)為2次，在此條件下提取得到的沙棘葉多糖得率最多7.95%，之后根據(jù)最優(yōu)提取條件進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，沙棘葉多糖得率為7.93%±0.07%，與優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)接近，提取參數(shù)可靠。最終所得多糖純度為79.34%±0.17%。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results

2.6 沙棘葉多糖對(duì)CT-26細(xì)胞的抑制作用

如圖5所示，通過MTT法檢測(cè)沙棘葉多糖對(duì)CT-26細(xì)胞的抑制作用。由圖5可知，當(dāng)多糖濃度為 250 μg/mL 的時(shí)候，抑制效果不顯著（P＞0.05），但隨著沙棘葉多糖濃度的增加，抑制作用越來越明顯，呈現(xiàn)濃度依賴性。當(dāng)多糖濃度增加到2000 μg/mL時(shí)，抑制作用達(dá)到最大（P＜0.05），繼續(xù)增加到2500 μg/mL時(shí)抑制效果差異不顯著（P＞0.05），因此采用2000 μg/mL濃度做后續(xù)的研究。

圖5 沙棘葉多糖對(duì)CT-26細(xì)胞的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of sea buckthorn polysaccharide on CT-26 cells

2.7 細(xì)胞形態(tài)變化

細(xì)胞凋亡指的是細(xì)胞程序性死亡，在此過程中細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生明顯的變化[20-21]。如圖6所示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，各個(gè)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞表面絨毛正常，經(jīng)過2000 μg/mL沙棘葉多糖處理后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器排序紊亂，大量液泡產(chǎn)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹且細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯的凋亡小體，由此說明沙棘葉多糖能夠抑制CT-26細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

圖6 透射電鏡觀察細(xì)胞變化Fig.6 Changes of cells observed by transmission electron microscope

2.8 沙棘葉多糖對(duì)細(xì)胞周期及凋亡率的影響

細(xì)胞周期分為分裂期（M期）、DNA合成前期（G0期）、DNA合成后期（G1期）和DNA合成期（S期）[22]。本試驗(yàn)檢測(cè)2000 μg/mL的沙棘葉多糖處理CT-26細(xì)胞72 h后對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果如圖7所示。與對(duì)照組相比，多糖組細(xì)胞G1期減小，但差異不顯著（P＞0.05），G2期也明顯的減小，差異也不顯著（P＞0.05），S 期細(xì)胞數(shù)量顯著性增多（P＜0.05），細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加（P＜0.05），由此說明，沙棘葉多糖可以通過通過阻滯CT-26細(xì)胞的S期來抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖7 沙棘葉多糖對(duì)CT-26細(xì)胞周期和凋亡率的影響Fig.7 Effect of polysaccharide from seabuckthorn leaves on cell cycle and apoptosis ratio of CT-26

2.9 沙棘葉多糖對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響

將2000 μg/mL沙棘葉多糖加入CT-26細(xì)胞并處理72 h后，通過RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中caspase-3、Bax、Bcl-2基因的表達(dá)變化。結(jié)果如圖8所示，經(jīng)過多糖處理后，caspase-3基因和Bax基因表達(dá)量顯著增大（P＜0.05），Bcl-2基因表達(dá)量顯著減?。≒＜0.05）。

圖8 CT-26細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化Fig.8 Effect of polysaccharide on apoptosis gene in CT-26 cell

2.10 沙棘葉對(duì)凋亡蛋白的影響

將2000 μg/mL的沙棘葉多糖加入CT-26細(xì)胞并處理72 h后，通過Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果如圖9所示，經(jīng)過多糖處理后，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量顯著增大（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)量顯著增大（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量與基因表達(dá)結(jié)果不同，沒有顯著性差異（P＞0.05）。Caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在人類細(xì)胞中Caspase-3的超量表達(dá)和激活均會(huì)引起細(xì)胞凋亡，因此，又稱死亡蛋白酶[23-24]，Bcl-2家族蛋白也是細(xì)胞凋亡過程中重要的凋亡蛋白之一，其蛋白家族中的Bcl-2蛋白可以抑制細(xì)胞的凋亡，Bax蛋白具有促進(jìn)凋亡的作用[25]。由此基因和蛋白結(jié)果證明，沙棘葉多糖確實(shí)能夠顯著促進(jìn)CT-26細(xì)胞的凋亡。

圖9 CT-26細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)變化Fig.9 Effect of polysaccharide on apoptosis protein in CT-26 cell

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取沙棘葉多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最終的優(yōu)化條件是：超聲波溫度為70 ℃、超聲波功率為400 W，超聲波時(shí)間為30 min，超聲波次數(shù)為2次。主次因素排序是：超聲波功率＞超聲波時(shí)間＞超聲波溫度＞超聲波次數(shù)，通過最優(yōu)條件提取的沙棘葉多糖得率達(dá)到最大為7.93%±0.07%。

沙棘粗多糖對(duì)結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞具有明顯的抑制作用，通過MTT試驗(yàn)結(jié)果可知，將不同濃度的沙棘葉多糖加入CT-26細(xì)胞處理72 h后能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞增殖，當(dāng)多糖濃度為2000 μg/mL時(shí)效果最佳，透射電鏡觀察細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)可知，2000 μg/mL沙棘葉多糖可通過阻滯CT-26細(xì)胞的S期來顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，由RT-PCR結(jié)果可知，沙棘葉多糖處理CT-26細(xì)胞后，能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)caspase-3表達(dá)以及Bax/Bcl-2比值（P＜0.05），由此闡明沙棘葉多糖對(duì)結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞具有抑制作用。后續(xù)將對(duì)沙棘葉粗多糖進(jìn)行分離純化，并進(jìn)一步解析多糖的結(jié)構(gòu)的組成，制備沙棘純多糖來深入研究其抗結(jié)腸癌的細(xì)胞信號(hào)通路，以期為沙棘葉在抗腫瘤領(lǐng)域的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。