產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株GXUN-20的篩選、鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

張 奇，王一兵,2, ，申乃坤，姜明國(guó)

（1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院, 廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西海洋微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心, 廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530008；2.廣西科學(xué)院, 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530007）

幾丁質(zhì)(Chitin)又名甲殼素、甲殼質(zhì)，是由N-乙酰-D-葡糖糖胺以β-1，4糖苷鍵連接而成的天然多聚體，其含量在自然界僅次于纖維素，廣泛存在于海產(chǎn)品蝦蟹的外殼、節(jié)肢動(dòng)物、大多數(shù)昆蟲的外骨骼，以及真菌和藻類等植物的細(xì)胞壁中[1]。近年來，海鮮的生產(chǎn)和消費(fèi)不斷增加，蝦蟹殼是目前主要的海鮮生產(chǎn)廢棄物[2]，由于技術(shù)和市場(chǎng)的限制，海鮮廢棄物的再利用受到了限制，其中有部分蝦蟹殼廢棄物用于堆肥或轉(zhuǎn)化為低附加值產(chǎn)品，比如動(dòng)物飼料和化肥，大部分廢棄物在沒有處理的情況下直接丟棄到環(huán)境中，如果處理不當(dāng)，會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害[3]。然而，這些蝦蟹殼廢棄物是具有高效益原材料的來源，可用于生產(chǎn)生物產(chǎn)品[4]。

蝦蟹殼中的幾丁質(zhì)不溶于水、稀酸、稀堿等常用試劑，嚴(yán)重限制了其商業(yè)應(yīng)用，幾丁質(zhì)經(jīng)幾丁質(zhì)酶（Chitinase）水解得到易溶于酸的殼聚糖[5]；殼聚糖是自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一堿性多糖，因其分子中有大量的游離氨基，所以溶解性能比幾丁質(zhì)有所改善，并具有生物可降解性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，具有很大的生物技術(shù)應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)前景[6]。目前，生產(chǎn)殼聚糖主要采用化學(xué)方法，但此方法耗能大，較危險(xiǎn)，且容易造成環(huán)境污染等問題[7]，酶解法生產(chǎn)殼聚糖綠色環(huán)保，反應(yīng)條件較溫和，耗材耗能相對(duì)較低，并且可以獲得脫乙酰程度較均一穩(wěn)定的產(chǎn)品，運(yùn)用幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)殼聚糖是近年來研究的熱點(diǎn)。因此，幾丁質(zhì)酶研究的重點(diǎn)在于篩選出產(chǎn)酶量高、適合大規(guī)模化生產(chǎn)的菌株，探索適合的發(fā)酵工藝等方面[8]。

海岸灘涂具有獨(dú)特的微生物環(huán)境，蘊(yùn)含著豐富的具有催化特性酶類的微生物資源[6]，其沉積物中含有大量蝦蟹及貝殼廢棄物，蝦蟹殼含有豐富的蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)，是碳和氮的重要來源[9]，尋找具有催化特性的幾丁質(zhì)酶類，不僅對(duì)降解蝦蟹殼廢棄物以提高其利用率、保護(hù)環(huán)境具有很好的指導(dǎo)作用[10]，而且蝦蟹殼降解后得到的豐富的碳氮源還可以減少農(nóng)藥和化肥的投入使用，能夠改善土壤肥力、增強(qiáng)土壤微生物菌群活力，為菌肥的研發(fā)提供了新思路[11]。因此，本研究從廣西合浦縣大神木海鴨場(chǎng)附近灘涂沉積物中篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌，并對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行16S rDNA屬種鑒定，對(duì)其中一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力較強(qiáng)菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究，提高發(fā)酵產(chǎn)酶水平，以期為降解蝦蟹殼酶法生產(chǎn)殼聚糖提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灘涂沉積物 中國(guó)廣西合浦縣大神木海鴨場(chǎng)，東經(jīng) 108°54′25″，北緯 21°37′25″，置于-15 ℃ 左右車載冰箱立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株篩選；細(xì)菌病原菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus1.10755）、大腸桿菌（Escherichia coli1.12883）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis1.15792）；真菌病原菌：黑曲霉（Aspergillus niger3.3928）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum3.18025）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani3.17046）、白色鏈霉菌（Streptomyces albus4.7658）

以上菌種均購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）；幾丁質(zhì) 生工生物工程（上海）股份有限公司；PCRMix 北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；引物 北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；其它試劑 國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

GI54DS高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；SW-CJ-1F單人雙面垂直凈化工作臺(tái) 上海汗諾儀器有限公司；ZXMP-A1230電熱恒溫培養(yǎng)箱、搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華儀器有限公司；LEGEND MICR 017微量臺(tái)式離心機(jī)、Multiskan Go 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；BioRad T100 Mastercycler nexus聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀 Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 DNS溶液、膠體幾丁質(zhì)溶液的配制：根據(jù)傅麗君等[12]的方法進(jìn)行DNS和膠體幾丁質(zhì)溶液的配制；LB 培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 5.0 g，酵母膏 5.0 g，胰蛋白胨 10.0 g，pH 7.0～8.0[13]（若為固體，加入瓊脂15.0 g）；PDA 培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂 15.0 g，pH 自然。

復(fù)合鹽母溶液（g/L）：K2HPO470.0 g，KH2PO430.0 g，MgSO4·7H2O 50.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0 g[14]。

液體富集培養(yǎng)基（g/L）：幾丁質(zhì)粉末 8.0 g，(NH4)2SO42.0 g，復(fù)合鹽母溶液 10 mL，pH7.2～7.5。

膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基（g/L）：膠體幾丁質(zhì)4.0 g，(NH4)2SO42.0 g，復(fù)合鹽母溶液10 mL，瓊脂15.0 g，pH7.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：幾丁質(zhì)粉末10.0 g，酵母粉5.0 g，蛋白胨5.0 g，復(fù)合鹽母溶液10 mL，pH7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：幾丁質(zhì)粉末10.0 g，(NH4)2SO42.0 g，復(fù)合鹽母溶液 10 mL，pH7.0。

1.2.2 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及發(fā)酵酶活測(cè)定 稱取灘涂沉積物樣品5.0 g，加入25 mL無菌水中，混勻后于30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)4 h，取1 mL上清液加入到29 mL液體富集培養(yǎng)基中，混勻后于30 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 3～4 d后，取樣液梯度稀釋至 10-3、10-4、10-5并分別吸取200 μL于膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上涂布分離，30 ℃倒置培養(yǎng)2～5 d[15-16]，觀察菌落生長(zhǎng)及透明圈產(chǎn)生情況，挑取產(chǎn)透明圈的菌株在LB固體培養(yǎng)基中純化出單菌落[17]，同時(shí)接種于LB斜面培養(yǎng)基-4 ℃低溫保藏及30%甘油管-80 ℃超低溫保藏。

挑選單菌落至種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2～3 d后，再以2%（v/v）接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基30 ℃、200 r/min培養(yǎng)4 d后，發(fā)酵液8000 r/min離心10 min取上清粗酶液。取1 mL膠體幾丁質(zhì)溶液（1%）于5 mL離心管中，45 ℃水浴預(yù)熱10 min之后加入1 mL稀釋粗酶液。45 ℃反應(yīng)1 h后，混勻取出200 μL加入300 μL DNS終止反應(yīng)，在沸水中顯色10 min，冷卻后加入300 μL去離子水，12000 r/min離心5 min，取上清液于540 nm處測(cè)吸光值，以煮沸滅活的上清液作為對(duì)照。酶活力單位（U）定義為：在45 ℃下每分鐘產(chǎn)生1 μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需要的酶量[8]。

1.2.3 菌株GXUN-20 16S rDNA擴(kuò)增及分析 煮沸法提取DNA模板：挑取單一菌落至EP管中，加入100 μL 20%的Chelex裂解液，振蕩煮沸30 min后，12000 r/min離心10 min，取上清。PCR引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GG TTACCTTGTTACGACTT-3'。反應(yīng)體系 50 μL：PCR Mix 23 μL，ddH2O 21 μL，上下游引物各 2 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性1 min，55 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 90 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，所得序列提交GenBank，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行16S rDNA序列的比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株GXUN-20的鑒定以及抑菌實(shí)驗(yàn) 產(chǎn)透明圈最大的菌株命名為GXUN-20，根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)對(duì)菌株GXUN-20進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定[18]。抑菌實(shí)驗(yàn)采取濾紙法[19]，將細(xì)菌病原菌分別接入 LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng) 12 h，吸取 50 μL至LB固體培養(yǎng)基涂布，在濾紙上滴加GXUN-20菌液8 μL后放置在LB培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)1 d；真菌病原菌分別接種至PDA培養(yǎng)基中央，在濾紙上滴加GXUN-20菌液8 μL后放置于真菌的對(duì)立面，25 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，分別觀察濾紙片四周是否有抑菌圈生成。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 優(yōu)化前發(fā)酵條件：發(fā)酵培養(yǎng)基，30 mL/150 mL 裝液量，2%（v/v）接種量，30 ℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)4 d，進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2.5.1 生長(zhǎng)曲線及最適發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間 分別在發(fā)酵的第 1、2、3、4、5、6、7、8 d檢測(cè) OD600及酶活。

1.2.5.2 碳源濃度的確定 將種子液接種到幾丁質(zhì)粉末添加量分別為 6.67、10.0、13.33、16.67、20 g/L的培養(yǎng)基中，其它發(fā)酵因素不變，恒溫培養(yǎng)測(cè)定酶活。

1.2.5.3 氮源及其添加量的確定 將種子液接種到分別以2 g/L的硫酸銨、蛋白胨、氯化銨、黃豆餅粉、尿素、牛肉膏為唯一氮源培養(yǎng)基中，在最適氮源基礎(chǔ)上進(jìn)行最適氮源添加量（1、2、3、4、5 g/L）優(yōu)化，其它發(fā)酵因素不變，恒溫培養(yǎng)測(cè)定酶活。

1.2.5.4 發(fā)酵培養(yǎng)溫度的確定 將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基后，置于溫度分別為 26、28、30、32、35、37 ℃搖床中，其它發(fā)酵因素不變，培養(yǎng)測(cè)定酶活。

1.2.5.5 發(fā)酵液初始pH 將種子液接種到發(fā)酵液初始 pH分別為 7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的培養(yǎng)基中，其它發(fā)酵因素不變，恒溫培養(yǎng)測(cè)定酶活。

1.2.5.6 接種量的確定 將種子液以接種量分別為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%（v/v）接種于培養(yǎng)基中，其它發(fā)酵因素不變，恒溫培養(yǎng)測(cè)定酶活。

1.2.6 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶影響較大的4個(gè)因素（氮源濃度、發(fā)酵液初始pH、碳源濃度、接種量）進(jìn)行4水平正交試驗(yàn)（表1）。單因素溫度優(yōu)化結(jié)果比幾丁質(zhì)粉末濃度優(yōu)化結(jié)果酶活力高，但考慮到該菌株是以幾丁質(zhì)為底物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，固選擇幾丁質(zhì)粉末添加量為4因素之一，以幾丁質(zhì)酶活力為考察指標(biāo)，探究該菌株最佳產(chǎn)酶條件。

表1 4因素4水平正交實(shí)驗(yàn)Table 1 Orthogonal experiment of 4 factors and 4 levels

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8作圖，采用SPSS21.0進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)均為三組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及發(fā)酵酶活測(cè)定結(jié)果

將富集培養(yǎng)的灘涂沉積物稀釋液涂布于膠體幾丁質(zhì)固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，菌株在膠體幾丁質(zhì)固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并產(chǎn)生白色透明圈，結(jié)果如圖1所示，挑選有透明圈的菌株純化至單菌落，共得到3株產(chǎn)丁質(zhì)酶菌株，將透明圈最大的菌株命名為GXUN-20。以N-乙酰-D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.9971，結(jié)果如圖2所示，按照酶活測(cè)定方法，測(cè)定該菌株未優(yōu)化之前幾丁質(zhì)酶的酶活為0.140 U/mL。

圖2 N-乙酰-D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of N-acetyl-D-glucosamine

2.2 菌株GXUN-20 16S rDNA擴(kuò)增及分析

將PCR產(chǎn)物送至生工生物（上海）股份有限公司，所得 1411 bp序列提交 GenBank檢索，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)里的序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Lysobacter firmicutimachus（登錄號(hào)：KU593484）菌株16S rDNA相似度最高為99.79%。運(yùn)用MEGA 6.0軟件進(jìn)行16S rDNA序列的對(duì)比分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3，從圖中可以看出 GXUN-20與Lysobacter firmicutimachus菌株親緣關(guān)系最接近，可初步鑒定GXUN-20（登錄號(hào)：MW897735）為厚壁溶桿菌。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建菌株GXUN-20系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain GXUN-20 based on 16S rDNA sequence

2.3 菌株GXUN-20的鑒定以及抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 菌株GXUN-20形態(tài)學(xué)鑒定 菌株GXUN-20的形態(tài)學(xué)觀察見圖4。菌株GXUN-20為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，菌落呈淡黃色圓形，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，中央飽滿突起，直徑0.1～0.5 mm，挑起有粘性，較易挑取，與Miess等[20]研究結(jié)果相似，在有氧條件下生長(zhǎng)于LB、R2A、TSA等培養(yǎng)基，菌落圓形凸出，奶油黃色，圓端非孢子棒狀，單個(gè)或成對(duì)出現(xiàn)，無氧條件下不生長(zhǎng)。

圖4 菌株GXUN-20的形態(tài)觀察結(jié)果Fig.4 Morphological observation results of strain GXUN-20

2.3.2 菌株GXUN-20生理生化特征 菌株GXUN-20部分生理生化試驗(yàn)結(jié)果及說明見表2。從結(jié)果得知，明膠液化試驗(yàn)、過氧化氫試驗(yàn)、SIM生化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、七葉苷試驗(yàn)均呈現(xiàn)陽性，VP、MR、硝酸鹽試驗(yàn)、甘露糖、麥芽糖、葡糖糖、木糖、鼠李糖試驗(yàn)均呈現(xiàn)陰性。

表2 菌株GXUN-20的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical tests results of strain GXUN-20

2.3.3 菌株GXUN-20抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成份[23]，幾丁質(zhì)酶可通過水解作用將幾丁質(zhì)裂解為可溶性寡糖[24]，從而裂解病原真菌細(xì)胞壁使其死亡[25]，利用分泌幾丁質(zhì)酶菌株對(duì)植物病原真菌進(jìn)行防治是目前生防領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一[26]。因此，實(shí)驗(yàn)菌株在細(xì)菌病原菌的基礎(chǔ)上加入真菌病原菌，探究GXUN-20菌株是否對(duì)細(xì)菌和真菌病原菌具有抑制效果。抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，GXUN-20對(duì)細(xì)菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、真菌白色鏈霉菌、尖孢鐮刀菌沒有明顯的抑菌圈，初步判斷沒有抑制作用，在真菌黑曲霉、立枯絲核兩株真菌生長(zhǎng)范圍內(nèi)看見較明顯抑菌圈，初步判斷該菌株對(duì)部分真菌有抑制作用，GXUN-20菌株抑制黑曲霉抑菌圈平均直徑為17.3 mm，抑制立枯絲核抑菌圈平均直徑為23.8 mm。

圖5 菌株GXUN-20抑制真菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Experimental results of fungi inhibition by strain GXUN-20

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 生長(zhǎng)曲線及其最適發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間的確定GXUN-20菌株的生長(zhǎng)曲線及發(fā)酵時(shí)間對(duì)該菌株產(chǎn)酶的結(jié)果如圖6所示。菌株GXUN-20在發(fā)酵條件下培養(yǎng)1～3 d繁殖數(shù)量少，處于生長(zhǎng)延滯期，酶活力也相對(duì)較低，3～6 d，處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期增殖加快，發(fā)酵液里菌體濃度增大，在這一階段幾丁質(zhì)酶活力也快速升高，并在第6 d菌液濃度和幾丁質(zhì)酶活力達(dá)到最高，最高酶活為 0.689 U/mL，6～8 d，進(jìn)入衰亡期，可能是由于發(fā)酵液里的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，產(chǎn)物的積累、pH變化等不利因素的影響[27]，菌株繁殖速度逐漸降低，幾丁質(zhì)酶活力也相對(duì)減弱。通過對(duì)GXUN-20菌株生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵時(shí)間的監(jiān)測(cè)最后確定該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適時(shí)間為6 d。

圖6 菌株GXUN-20的生長(zhǎng)曲線以及最適發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間曲線Fig.6 Growth curve and optimal fermentation time curve of strain GXUN-20

2.4.2 碳源濃度的確定 幾丁質(zhì)粉末為GXUN-20菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的唯一碳源，最適添加量對(duì)產(chǎn)酶酶活力影響如圖7所示。未優(yōu)化之前該菌株酶活力為0.140 U/mL，幾丁質(zhì)粉末添加量為16.67 g/L時(shí)，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力最高，可達(dá)到0.351 U/mL，酶活力約為優(yōu)化前的2.51倍，因此確定GXUN-20菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的碳源最適添加量為16.67 g/L。碳源添加量過少時(shí)，菌體生長(zhǎng)所需碳源不足，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)不充分，酶活力降低，碳源濃度增大，在發(fā)酵過程中發(fā)酵液會(huì)越來越粘稠，搖瓶不充分，導(dǎo)致酶活力降低[8]。

圖7 菌株GXUN-20碳源濃度的確定Fig.7 Determination of carbon source concentration of strain GXUN-20

2.4.3 最適氮源的篩選 氮源是微生物生長(zhǎng)必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，也是生物體酶、結(jié)構(gòu)蛋白的重要來源[28]，可作為代謝的前體物質(zhì)，直接參與次生代謝[29]。GXUN-20最適氮源篩選結(jié)果如圖8所示，該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的氮源分為無機(jī)氮和有機(jī)氮，以無機(jī)氮硫酸銨和氯化銨為氮源時(shí)該菌株的酶活分別達(dá)到0.570和0.519 U/mL，以黃豆餅粉為氮源時(shí)該菌株酶活力最高，酶活力為0.600 U/mL，是優(yōu)化前的4.29倍。有研究表明與其他氮源相比，黃豆餅粉營(yíng)養(yǎng)更豐富，更容易被利用，是因?yàn)辄S豆餅粉不僅僅提供必要的氮元素之外，還提供了很多必需的生長(zhǎng)因子[30]。因此，確定GXUN-20菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適有機(jī)氮源為黃豆餅粉，硫酸銨是較好的無機(jī)氮源，也說明該菌株既能利用有機(jī)氮源也能利用無機(jī)氮源。

圖8 菌株GXUN-20最適氮源的篩選Fig.8 Screening of optimum nitrogen source for strain GXUN-20

2.4.4 最適氮源添加量的確定 氮源添加量對(duì)GXUN-20菌株發(fā)酵產(chǎn)酶酶活力的影響如圖9所示。低濃度和高濃度的黃豆餅粉都不利于該菌株發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，馬璐等[31]研究發(fā)現(xiàn)低濃度氮源不足以維持菌體生長(zhǎng)需要，當(dāng)?shù)礉舛雀邥r(shí)相對(duì)碳源濃度低，細(xì)菌沒有充足能量合成蛋白質(zhì)和進(jìn)行生命活動(dòng)，因此合適的碳氮比可促進(jìn)菌體生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的積累。隨著黃豆餅粉濃度的增加，幾丁質(zhì)酶活力先增加后下降，在黃豆餅粉達(dá)到3 g/L時(shí)，該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力最高，達(dá)到0.486 U/mL，是優(yōu)化前的3.47倍。因此，確定GXUN-20菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適氮源添加量為3 g/L。

圖9 菌株GXUN-20最適氮源黃豆餅粉添加量的確定Fig.9 Determination of the optimum nitrogen source for soybean cake powder of strain GXUN-20

2.4.5 最適溫度的確定 GXUN-20菌株酶活力隨溫度變化結(jié)果如圖10所示。低溫菌體生長(zhǎng)減緩，釋放酶蛋白減少，總體酶活性不高，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，呼吸強(qiáng)度增加，代謝速度增強(qiáng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖加速[32]，幾丁質(zhì)酶活力上升，在30 ℃時(shí)，幾丁質(zhì)酶活力達(dá)到最高為0.458 U/mL，是優(yōu)化前的3.27倍，隨著溫度繼續(xù)升高，高溫會(huì)讓酶蛋白失活變性，酶活力有所下降，因此，確定GXUN-20菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度為30 ℃。

圖10 菌株GXUN-20最適溫度的確定Fig.10 Determination of the optimum temperature of strain GXUN-20

2.4.6 發(fā)酵液初始最適pH的確定 菌株GXUN-20發(fā)酵液初始最適pH對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖11所示。pH偏低，發(fā)酵液偏酸性，不利于菌體生長(zhǎng)，酶活力不高，在一定pH范圍內(nèi)，隨著pH的升高，發(fā)酵液偏弱堿性，有利于該菌株生長(zhǎng)，酶活力增強(qiáng)，在pH=8.4時(shí)，GXUN-20菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力最大，為0.659 U/mL，是優(yōu)化前的4.71倍，隨著pH繼續(xù)增大，發(fā)酵液偏堿性，堿性會(huì)讓酶蛋白變性失活，酶活力減弱，表明該菌株適合弱堿性的產(chǎn)酶環(huán)境，可能是因?yàn)樵摼晟L(zhǎng)在堿性的海岸環(huán)境中，而大部分細(xì)菌最適發(fā)酵產(chǎn)酶的pH在6.3～7.5[32]。

圖11 菌株GXUN-20最適發(fā)酵液pH的確定Fig.11 Determination of the optimum pH of fermentation liquor of strain GXUN-20

2.4.7 發(fā)酵液最適接種量確定 GXUN-20菌株發(fā)酵液最適接種量?jī)?yōu)化結(jié)果如圖12。接種量在2%（v/v）時(shí)，GXUN-20產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力最大，為0.501 U/mL，是優(yōu)化前的3.58倍。隨著接種量的增加，過高的接種量會(huì)極具地消耗培養(yǎng)基中的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[17]，所以菌株的酶活力逐漸減弱，因此，GXUN-20菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適接種量為2%。

圖12 菌株GXUN-20最適接種量的確定Fig.12 Determination of optimum inoculation amount of strain GXUN-20

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L16（44）正交試驗(yàn)，對(duì)因素A：氮源黃豆餅粉濃度、B：pH、C：碳源幾丁質(zhì)粉末濃度、D：接種量，4因素之間的相互作用做進(jìn)一步的研究。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出kn值和R值，得出的最佳發(fā)酵方案為：A1B3C4D4，即黃豆餅粉 1 g/L，發(fā)酵液初始 pH8.4，幾丁質(zhì)粉末 20 g/L，接種量 3%；R值 A＞C＞B＞D，A為最顯著因素，正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果見表4，得出黃豆餅粉對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P=0.013＜0.05），即氮源對(duì)GXUN-20菌株產(chǎn)酶影響最為明顯。以正交試驗(yàn)得出GXUN-20菌株最適發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行產(chǎn)酶酶活力驗(yàn)證，黃豆餅粉1 g/L，幾丁質(zhì)粉末20 g/L，復(fù)合鹽母溶液10 mL，pH8.4，接種量3%，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)6 d后，檢測(cè)液體酶活力為0.965 U/mL，是優(yōu)化前的6.89倍。

表3 L16(44)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of L16 (44) orthogonal experiment

表4 GXUN-20菌株正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test of GXUN-20 strain

3 結(jié)論與討論

自然環(huán)境中蝦蟹殼的降解主要是由微生物完成的，為了提高蝦蟹等海產(chǎn)品廢棄物利用率及其附加值，本研究從廣西合浦縣大神木海鴨場(chǎng)附近灘涂沉積物（蝦蟹及貝殼廢棄物）中篩選出一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株GXUN-20，經(jīng)16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定與Lysobacter firmicutimachus相似度為99.79%，為厚壁溶桿菌，與蝦蟹殼土壤[33]、黃粉蟲蟲蛻[16]中篩選到的幾丁質(zhì)降解菌株類芽孢桿菌屬的結(jié)果不一致，說明產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株分類廣泛。以幾丁質(zhì)酶活力為指標(biāo)，對(duì)GXUN-20菌株進(jìn)行發(fā)酵條件單因素優(yōu)化，在單因素優(yōu)化結(jié)果較顯著的4因素（氮源濃度、發(fā)酵液初始pH、幾丁質(zhì)粉末濃度、接種量）基礎(chǔ)上進(jìn)行4水平正交試驗(yàn)及正交試驗(yàn)方差分析。結(jié)果顯示：氮源濃度對(duì)產(chǎn)酶影響顯著（P=0.013＜0.05），在氮源為1 g/L黃豆餅粉，幾丁質(zhì)粉末為20 g/L，接種量為3%，發(fā)酵液初始 pH 8.4，30 ℃、200 r/min發(fā)酵 6 d條件下，發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力最大，達(dá)0.965 U/mL，是優(yōu)化前酶活力的6.89倍。本研究結(jié)果為GXUN-20菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)方法，也為進(jìn)一步探究降解蝦蟹殼酶法生產(chǎn)殼聚糖提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)溶桿菌屬產(chǎn)幾丁質(zhì)酶方面的研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)Lysobacter enzymogenes菌株可產(chǎn)幾丁質(zhì)酶[20]，Qian 等[34]、朱慧等[35]研究Lysobacter enzymogenes對(duì)辣椒疫霉具有抑制作用以及該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的分子機(jī)制。由于Lysobacter firmicutimachus菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶相關(guān)研究缺乏，本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了GXUN-20菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵培養(yǎng)條件，通過對(duì)該菌株的生長(zhǎng)曲線以及最適產(chǎn)酶時(shí)間的測(cè)定，得出該菌株生長(zhǎng)密度與產(chǎn)酶活力呈正相關(guān)，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著該菌株的生長(zhǎng)，發(fā)酵液里菌體濃度不斷增加，該菌株降解幾丁質(zhì)產(chǎn)還原糖的能力增加，即幾丁質(zhì)酶活力增加，并在菌體生長(zhǎng)達(dá)到頂峰時(shí)，幾丁質(zhì)酶活力也達(dá)到最大，這與陳立功等人的研究基本一致[36]。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵環(huán)境越來越不適合該菌株的生長(zhǎng)，發(fā)酵液中氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及代謝物的增加，菌株濃度慢慢降低，幾丁質(zhì)酶活力也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)[27]。

幾丁質(zhì)粉末為該菌株發(fā)酵培養(yǎng)的唯一碳源，在單因素優(yōu)化中，分別以不同濃度的碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶活力測(cè)定，結(jié)果在幾丁質(zhì)粉末為16.67 g/L時(shí)，GXUN-20菌株產(chǎn)酶活力最高，碳源添加量過少，菌體生長(zhǎng)所需碳源不足，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)不充分，酶活力降低，碳源濃度增大，在發(fā)酵過程中發(fā)酵液越發(fā)粘稠，搖瓶不充分，導(dǎo)致酶活力降低。不同氮源對(duì)GXUN-20菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶具有明顯的影響，以硫酸銨、氯化銨、黃豆餅粉作為氮源時(shí)該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力較高，以蛋白胨、牛肉膏、尿素為氮源時(shí)該菌株幾丁質(zhì)酶表達(dá)量較低，有機(jī)氮源黃豆餅粉單因素優(yōu)化之后該菌株產(chǎn)酶活力最大，但與無機(jī)氮源硫酸銨差別不大，為考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本問題，后期可以考慮選擇無機(jī)銨鹽代替黃豆餅粉進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。

pH能影響菌株形態(tài)、生長(zhǎng)以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和代謝物產(chǎn)生[32]。在菌株GXUN-20 pH單因素優(yōu)化研究中，前期pH單因素研究設(shè)計(jì)pH范圍為4～10，得出最適產(chǎn)酶pH為8，考慮到較強(qiáng)度的酸堿會(huì)影響菌株產(chǎn)酶能力，所以在前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上縮小pH優(yōu)化范圍，最后pH優(yōu)化范圍為7.8～9.0，得出該菌株最適發(fā)酵產(chǎn)酶pH為8.4。在單因素溫度優(yōu)化研究中GXUN-20菌株最適產(chǎn)酶溫度為30 ℃，隨著溫度的升高，酶蛋白失活變性，GXUN-20菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力降低。

幾丁質(zhì)酶是一類差異較大的水解酶，由于菌株的來源不同，其酶學(xué)性質(zhì)不盡相同，幾丁質(zhì)酶對(duì)底物的親和力也不同[16]，本研究測(cè)定酶活力是以幾丁質(zhì)粉末為底物，還需進(jìn)一步使用蝦蟹殼粉末為底物，測(cè)定該菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對(duì)蝦蟹殼粉末的降解效果，利用幾丁質(zhì)酶直接降解蝦蟹殼粉末，制備蝦蟹殼降解產(chǎn)物，才能真正地實(shí)現(xiàn)蝦蟹殼廢棄物的資源化利用。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)GXUN-20對(duì)黑曲霉、立枯絲核具有抑菌作用，因此，可以嘗試將該菌株投入大田實(shí)驗(yàn)，研究生防菌劑來達(dá)到生物防治植物真菌病害的目的。