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    基于聚類分析和主成分分析的洋槐蜜成熟過程中主要成分變化研究

    2021-12-16 05:39:02吳美佳黎洪霞周金慧陳蘭珍
    食品工業(yè)科技 2021年24期
    關(guān)鍵詞:洋槐低聚糖苯甲酸

    吳美佳,佘 僧,黎洪霞,尹 欣,周金慧,2,陳蘭珍,2,

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所, 北京 100093;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100093)

    蜂蜜作為一種天然食品,經(jīng)蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或分泌物,在蜂巢中經(jīng)濃縮、揮發(fā)等加工釀制而成。蜂蜜中富含多種營(yíng)養(yǎng)成分,如糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、酶以及其它微量物質(zhì)維生素、有機(jī)酸、酚類物質(zhì)和芳香物質(zhì)等[1-2]。蜂蜜中的低聚糖和多酚具有很高的生物活性功能及醫(yī)藥價(jià)值。低聚糖可不經(jīng)腸胃消化而直接被人體吸收,以減少腸胃負(fù)擔(dān),此外還具有調(diào)節(jié)血糖、抗菌等功效[3],酚類化合物在預(yù)防和治療胃腸道疾病、水腫、癌癥、代謝問題、心血管疾病及炎癥等方面有很好的應(yīng)用[4-6]。蜂蜜品質(zhì)的好壞主要受蜜源植物、地理氣候、蜂種、后期加工儲(chǔ)存以及蜂蜜是否成熟等多種因素的影響[7],其中蜂蜜的成熟過程決定了真實(shí)蜂蜜全部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分[8]。我國(guó)傳統(tǒng)養(yǎng)蜂方式大多采取“追花逐蜜”,為在花期內(nèi)增大產(chǎn)量和減少成本以達(dá)到高利潤(rùn)的目的,會(huì)采取提前搖蜜、縮短取蜜周期的方式[9]。這種生產(chǎn)模式下的蜂蜜并未成熟,含水量較多,需要人工進(jìn)行濃縮處理,會(huì)造成蜂蜜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。造成這種情況的原因除了我國(guó)特殊的養(yǎng)蜂模式外,還有蜂蜜的自然成熟過程研究不足,且缺乏完善的成熟蜜判定標(biāo)準(zhǔn)。洋槐蜜來源于木本植物洋槐(Robinia pseudoacaciaL.)的花蜜,不易結(jié)晶、味道香甜醇厚、略有清香味[10],是一種深受消費(fèi)者喜愛的單花種蜂蜜。我國(guó)北方地區(qū)是洋槐蜜的主產(chǎn)區(qū),主要分布于遼寧、河北、山西、山東、陜西和甘肅等地。受地域、氣候等環(huán)境因素的影響,各地的洋槐開花時(shí)間略有差異,一般集中在四月至六月。相對(duì)油菜、荊條等蜜源植物而言,洋槐的花期及流蜜期較短,一般維持在15 d和7 d左右。為增大洋槐蜜產(chǎn)量,在洋槐花期及流蜜期內(nèi)會(huì)采取提前搖蜜的方式,使得洋槐蜜成熟度不足。

    已有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)蜂蜜在成熟過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化進(jìn)行報(bào)道,遲韻陽[11]測(cè)定了油菜和洋槐蜜的花蜜、蜜囊蜜、水蜜和成熟蜜的糖含量,發(fā)現(xiàn)蜂蜜成熟過程中主要發(fā)生的變化為蔗糖水解為果糖和葡萄糖,且隨著蜜蜂的不斷加工,蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖等糖的總含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。馬天琛[12]研究表明,成熟和非成熟洋槐蜜的理化指標(biāo)存在顯著差異(P<0.05),非成熟洋槐蜜經(jīng)濃縮后總酚酸和總黃酮含量明顯下降。Gismondi等[13]通過對(duì)比洋槐蜜和洋槐花蜜,發(fā)現(xiàn)洋槐蜜成熟以后其糖及簡(jiǎn)單酚類等物質(zhì)含量增加,水分含量顯著降低,此外,研究還發(fā)現(xiàn)成熟洋槐蜜的體外抗氧化、真核細(xì)胞抗氧化及抑菌實(shí)驗(yàn)效果都優(yōu)于洋槐花蜜。然而,目前尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)蜂蜜成熟過程中低聚糖及多酚類物質(zhì)含量變化的相關(guān)研究。

    我國(guó)目前缺乏成熟蜜的判定依據(jù),本研究通過測(cè)定洋槐蜜成熟過程中水分、單糖及二糖、9種低聚糖及18種多酚含量,揭示其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性的變化規(guī)律,挖掘成熟洋槐蜜的特征指標(biāo),旨在為成熟洋槐蜜的采收提供合理意見,并為成熟蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)制定提供數(shù)據(jù)和理論支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    本實(shí)驗(yàn)選取山西省晉城市沁水縣(海拔1010 m,N: 35°52′40,E: 112°15′48)作為采樣點(diǎn),為保證蜜源充足和排除其他干擾因素,試驗(yàn)時(shí)間選擇洋槐花期的5月中旬,從同一蜂場(chǎng)選取意蜂蜂群無病害且群勢(shì)相同的三個(gè)蜂箱,并提前對(duì)其巢脾做清空處理;分別從三個(gè)蜂箱內(nèi)采集第3、5、8和11 d蜂蜜樣本,每個(gè)蜂箱采集3個(gè)樣本,共收集36個(gè)樣本。乙腈、吡啶、β-苯基葡萄糖苷、HMDS+TMS+吡啶、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和9種低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(麥芽酮糖、松二糖、帕拉金糖、異麥芽糖、麥芽三糖、潘糖、蔗果三糖、吡喃基葡蔗糖、松三糖) 北京百靈威科技有限公司;18種多酚標(biāo)準(zhǔn)品:沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、蘆丁、苯甲酸、楊梅酮、桑色素、槲皮素、柚皮苷、芹菜素、山奈酚、柯因、松屬素、咖啡酸苯乙酯、高良姜素 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;所有試劑未明確標(biāo)注純度的均屬于分析純。

    阿貝折光儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司;PL203電子天平(精確度:0.0001) 美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司;Milli-Q型純水器 美國(guó)Millipore公司;CR22GⅡ冷凍離心機(jī) 日本Himac公司;TTLDC氮吹儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;恒溫干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;2695-高效液相色譜儀、6460-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;QP2010-PIUS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 樣品處理 36個(gè)洋槐蜜樣品均先室溫放置2 h后,攪拌使樣品混合均勻。

    1.2.2 水分、單糖及二糖含量測(cè)定 水分測(cè)定方法參考AOAC Official Method 969.38[14]和Heinz-Dieter等[15]的方法,使用阿貝折光儀在25 ℃條件下進(jìn)行測(cè)定。果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的測(cè)定方法參考《GB 5009.8-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》[16]。具體步驟為:準(zhǔn)確稱取2.0 g蜂蜜樣本(精確至0.0001 g)至50 mL容量瓶中,加水定容至刻度,混勻,4℃下8000 r/min離心5 min,取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后裝入1.5 mL進(jìn)樣瓶,利用HPLC進(jìn)行測(cè)定。

    1.2.3 低聚糖含量測(cè)定 9種低聚糖的檢測(cè)方法參照She等[17]的方法。具體步驟為:稱取0.5 g洋槐蜜樣本于50 mL離心管中,向其中加入25 mL 80%乙醇溶液,旋渦充分溶解,于4 ℃下10000 r/min離心10 min后,取上清液 100 μL,50 ℃ 下氮?dú)獯蹈?,加?0 μLβ-苯基葡萄糖苷(0.25 mg/mL,溶于吡啶),加入200 μL 2%鹽酸羥氨溶液,于70 ℃下反應(yīng)30 min,然后加入衍生劑HMDS+TMS+吡啶300 μL,于70 ℃下反應(yīng) 40 min,在 4 ℃下 10000 r/min離心 5 min,取上清液,利用GC-MS進(jìn)行測(cè)定。

    1.2.4 多酚含量測(cè)定 18種多酚類物質(zhì)的檢測(cè)方法參考Tanleque-Alberto等[18]和Dittgen等[19]的方法。具體步驟為:稱取洋槐蜜樣本5.0 g,置于50 mL離心管中,加入30 mL鹽酸水溶液(pH=2),旋渦充分溶解,于4 ℃下10000 r/min離心10 min,取上清液待固相萃取。Oasis HLB固相萃取柱依次用10 mL甲醇和10 mL鹽酸水溶液(pH=2)活化,然后將蜂蜜樣本上清液倒入活化后的Oasis HLB固相萃取柱,再用10 mL超純水清洗萃取柱,隨后用10 mL甲醇洗脫酚類物質(zhì)。洗脫液在40 ℃氮?dú)獯蹈珊螅? mL 0.1%甲酸:乙腈(90:10, v/v)溶液溶解。將復(fù)溶液用0.22 μm尼龍膜過濾后裝入1.5 mL進(jìn)樣瓶,利用HPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件(IBM,美國(guó))對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)(采用LSD法進(jìn)行多重比較,不同小寫字母表示在P<0.05水平下差異顯著),柱狀圖和折線圖采用 Origin 8.5(Origin Lab,美國(guó))繪制,熱點(diǎn)圖和聚類圖通過上傳數(shù)據(jù)到在線程序中繪制完成,網(wǎng)址如下:https://software.broadinstitute.org/morpheus/。主成分分析利用SIMCA 14.1軟件(Umetrics,瑞典)完成。每個(gè)樣本做三次平行實(shí)驗(yàn),同一蜂箱內(nèi)三個(gè)樣本做平均值處理,聚類分析和主成分分析前,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 洋槐蜜成熟過程中水分、單糖及二糖含量變化規(guī)律

    表1為洋槐蜜成熟過程中水分、單糖及二糖含量變化圖,結(jié)果表明,水分含量在洋槐蜜成熟過程中不斷降低,且在不同成熟天數(shù)下含量差異顯著(P<0.05)。在第11 d封蓋時(shí)水分含量為16.33 g/100 g,整個(gè)成熟過程中水分含量下降了5.77 g/100 g。此外,果糖在洋槐蜜不同成熟天數(shù)下無顯著性差異(P>0.05),含量保持穩(wěn)定。而葡萄糖含量在不同成熟天數(shù)下差異顯著(P<0.05),呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。蔗糖和麥芽糖未檢出。

    表1 洋槐蜜成熟過程中主要成分含量(g/100 g)Table 1 Main components contents of acacia honey during the ripening process (g/100 g)

    水分含量是評(píng)定蜂蜜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要參數(shù)指標(biāo)。蜂蜜成熟過程中水分含量下降,主要是由于蜂巢中內(nèi)勤蜂不斷煽動(dòng)翅膀加速水分蒸發(fā),并將蜜液涂到巢房壁上以增大水分蒸發(fā)面積[20]。而葡萄糖含量在洋槐蜜成熟后期含量下降,可能是被蜂蜜中的葡萄糖氧化酶氧化成過氧化氫和葡萄糖酸所致[21]。

    2.2 洋槐蜜成熟過程中低聚糖含量變化規(guī)律

    低聚糖在洋槐蜜成熟過程中含量變化趨勢(shì)(見圖1)可以歸納為以下幾個(gè)方面:麥芽酮糖(0.54~1.39 g/100 g)、松二糖(1.78~3.43 g/100 g)、吡喃基葡蔗糖(0.20~2.63 g/100 g)、異麥芽糖(0.13~0.38 g/100 g)的含量大致呈現(xiàn)上升趨勢(shì),且成熟后期與成熟初期含量差異顯著(P<0.05);帕拉金糖(0.16~1.23 g/100 g)的含量先升高后降低;三糖的含量逐漸降低,其中蔗果三糖(0.17 g/100 g降至 0.08 g/100 g)、松三糖(3.53 g/100 g降至0.06 g/100 g)表現(xiàn)的較為明顯,成熟后期其含量顯著低于初期含量(P<0.05);麥芽三糖(0.06 g/100 g 左右)和潘糖(0.06 g/100 g左右)的含量在洋槐蜜成熟過程中無明顯變化,含量都較低。

    圖1 洋槐蜜成熟過程中低聚糖含量變化Fig.1 Changes of oligosaccharides contents of acacia honey during the ripening process

    對(duì)于上述低聚糖含量的變化趨勢(shì),上級(jí)營(yíng)養(yǎng)物中部分三糖或多糖的分解過程非常緩慢,可能是由于花蜜中各糖類化合物相應(yīng)的分解酶少,因此蔗果三糖、松三糖在洋槐蜜成熟初期含量較高。此后,松三糖的含量在洋槐蜜成熟過程中不斷降低,可能是被α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化所致,α-葡萄糖苷酶由蜜蜂分泌產(chǎn)生,且隨著蜜蜂不斷吞吐蜂蜜,酶含量相應(yīng)增加,松三糖被轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖[22],故松三糖的含量持續(xù)降低,其含量在洋槐蜜不同成熟天數(shù)下差異顯著,故松三糖可以作為判定洋槐蜜成熟的潛在特征指標(biāo)。而部分糖類物質(zhì)如吡喃基葡蔗糖、異麥芽糖在初始天數(shù)中的含量不高,這可能是因蜜源植物洋槐花蜜腺體中這些糖類化合物的含量很低所致。此外,麥芽三糖和潘糖的含量在洋槐蜜成熟過程中一直處于較低水平,故不建議二者作為蜂蜜成熟度判定的指標(biāo)。

    2.3 洋槐蜜成熟過程中多酚含量變化規(guī)律

    圖2A、B、C、D為洋槐蜜中多酚在不同成熟天數(shù)下的含量變化圖。18種多酚類物質(zhì)的含量變化大致可分為以下幾種趨勢(shì):從整體上看,蘆丁、山奈酚、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸的含量在洋槐蜜成熟過程中呈現(xiàn)上升趨勢(shì),其中山奈酚、對(duì)羥基苯甲酸含量在不同成熟天數(shù)下均明顯上升,而蘆丁、原兒茶酸在采蜜期3 d之前含量較低,3 d之后含量顯著上升(P<0.05),在 5~11 d差異不顯著;此外,沒食子酸、桑色素、阿魏酸、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸、柯因的含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),其中沒食子酸、阿魏酸和柯因在采蜜期5~8 d含量較高,咖啡酸、桑色素在5 d時(shí)含量最高,而高良姜素、咖啡酸苯乙酯在8 d時(shí)含量最高;而苯甲酸、對(duì)香豆酸含量呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì);柚皮苷含量呈現(xiàn)波動(dòng)式變化;而楊梅酮、槲皮素、芹菜素、松鼠素在洋槐蜜成熟過程中含量大致趨于平穩(wěn),無顯著變化。

    圖2 洋槐蜜成熟過程中多酚含量變化Fig.2 Changes of polyphenol contents of acacia honey during the ripening process

    本文所述18種多酚類物質(zhì)曾被廣泛應(yīng)用于真實(shí)性溯源和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等研究[23-27]。本研究發(fā)現(xiàn),上述多酚的含量在洋槐蜜整個(gè)成熟過程中存在差異。其中對(duì)羥基苯甲酸的含量在洋槐蜜成熟過程中一直占據(jù)總酚含量(18種多酚含量總和)的50%左右,且隨著蜂蜜成熟度的提升,含量不斷升高。對(duì)羥基苯甲酸和咖啡酸含量在洋槐蜜不同成熟天數(shù)下均變化顯著,建議可以作為評(píng)價(jià)洋槐蜜是否成熟的指標(biāo)。此外,黃酮醇類化合物的含量在整個(gè)過程一直低于其他類別的化合物。黃酮醇類物質(zhì)中除蘆丁、山奈酚含量不斷升高外,桑色素、高良姜素含量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),而楊梅酮和槲皮素的含量在蜂蜜成熟過程中趨于穩(wěn)定。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,花蜜中存在黃酮類物質(zhì),洋槐花蜜的黃酮類化合物是鼠李糖苷,它們不被蜂蜜和蜜蜂唾液中存在的酶水解[28-29],這可能是山奈酚等幾種物質(zhì)在洋槐蜜成熟過程中含量沒有減少的原因。而桑色素和高良姜素在蜂蜜成熟后期過程中含量有下降趨勢(shì),可能是由于蜂蜜中存在的過氧化氫導(dǎo)致這幾種黃酮醇類化合物降解[23]。與此同時(shí),沒食子酸、山奈酚、對(duì)香豆酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸和柯因六種多酚類物質(zhì)在洋槐蜜成熟3和11 d時(shí)相較5~8 d時(shí)含量變化明顯,這可能意味著蜂蜜成熟初期和后期是多酚變化最明顯的時(shí)期。而楊梅酮、槲皮素、芹菜素和松鼠素含量在不同成熟天數(shù)下差異不明顯,在洋槐蜜成熟過程中其含量一直保持穩(wěn)定,故不建議作為判定洋槐蜜是否成熟的指標(biāo)。

    2.4 聚類分析

    層次聚類分析(HCA)可以顯示數(shù)據(jù)基于不同度量的自然分組[30],熱點(diǎn)圖和聚類圖能分別顯示數(shù)據(jù)的活動(dòng)和聚集狀態(tài),實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的視覺互補(bǔ)化。以標(biāo)準(zhǔn)化后的9種低聚糖和18種多酚數(shù)據(jù)為變量,對(duì)不同成熟天數(shù)下的洋槐蜜進(jìn)行聚類分析,聚類距離采用歐式距離,聚類方法采用單鏈連接法,熱點(diǎn)圖及樹狀圖如圖3所示。當(dāng)距離為7時(shí),成熟天數(shù)為3、5、8和11 d的洋槐蜜被很好地劃分為4類。

    圖3 洋槐蜜成熟過程中低聚糖及多酚含量熱點(diǎn)-樹狀圖Fig.3 Heat map and dendrogram of oligosaccharide and polyphenol contents of acacia honey during the ripening process

    2.5 主成分分析

    主成分分析是一種數(shù)據(jù)降維技術(shù),它將大量原有的相關(guān)變量替換為少量不相關(guān)的主成分(即派生變量),同時(shí)盡可能多地保留原始數(shù)據(jù)集中存在的內(nèi)部變量信息[31]。對(duì)不同成熟天數(shù)下的洋槐蜜中9種低聚糖和18種多酚進(jìn)行主成分分析,提取出特征值大于1的3個(gè)主成分。其中第一主成分特征值為4.35,貢獻(xiàn)率為40.39%,第二主成分特征值為2.92,貢獻(xiàn)率為20.95%,第三主成分特征值為1.5,貢獻(xiàn)率為15.0%,三個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到76.34%,可以解釋原始數(shù)據(jù)的大部分信息。前三個(gè)主成分得分圖及載荷圖如圖4所示,圖4A顯示不同成熟天數(shù)下的洋槐蜜分布在不同的區(qū)域,且無重疊,說明低聚糖結(jié)合多酚可以很好地實(shí)現(xiàn)不同成熟度洋槐蜜的區(qū)分。圖4B顯示了第一主成分主要與山奈酚、蘆丁、麥芽三糖、異麥芽糖、麥芽酮糖、松二糖、原兒茶酚、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸、蔗果三糖、苯甲酸、松三糖相關(guān)性較強(qiáng),第二主成分主要與沒食子酸、柯因、咖啡酸苯乙酯、松鼠素、高良姜素、帕拉金糖、對(duì)香豆酸、松二糖、麥芽酮糖、異麥芽糖、潘糖相關(guān)性較強(qiáng)。第三主成分主要與楊梅酮、帕拉金糖、柚皮苷、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、松三糖、槲皮素、松鼠素、高良姜素、柯因相關(guān)性較強(qiáng)。

    圖4 洋槐蜜主成分分析三維得分圖(A)及載荷圖(B)Fig.4 3-dimensional score plot (A) and loading plot (B) of PCA of acacia honey

    3 結(jié)論

    本文通過測(cè)定洋槐蜜成熟過程中的水分、單糖及二糖、9種低聚糖以及常見的18種多酚類化合物含量,并結(jié)合分層聚類及主成分分析兩種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明:洋槐蜜在成熟過程中,水分含量不斷下降,低聚糖中部分三糖,如蔗果三糖、松三糖的含量不斷降低,少數(shù)三糖如吡喃基葡蔗糖含量升高,而麥芽三糖和潘糖的含量保持穩(wěn)定,一直處于較低水平。多數(shù)二糖如麥芽酮糖、松二糖、異麥芽糖的含量不斷上升,帕拉金糖的含量則屬于先升高后降低。其次,多酚中大部分物質(zhì)含量呈現(xiàn)一定的規(guī)則性變化。多酚類物質(zhì)中蘆丁、山奈酚、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸的含量總體升高,沒食子酸、桑色素、阿魏酸、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸、柯因的含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),苯甲酸、對(duì)香豆酸含量呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)。而松三糖、對(duì)羥基苯甲酸和咖啡酸含量在洋槐蜜不同成熟天數(shù)下分別呈現(xiàn)顯著降低、顯著升高和顯著升高趨勢(shì)(P<0.05),建議可以將這三種物質(zhì)作為評(píng)價(jià)洋槐蜜是否成熟的指標(biāo)。此外,聚類分析和主成分分析結(jié)果都表明:低聚糖和多酚可以很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)不同成熟天數(shù)下洋槐蜜的區(qū)分。綜上可知,低聚糖和多酚結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)研究洋槐蜜成熟過程具有一定的參考價(jià)值。

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