點柄乳牛肝菌多糖的結(jié)構(gòu)表征及其免疫調(diào)節(jié)活性的研究

祁嘉儀，曾冉華，陳忠正，林曉蓉，張玉婷，吳吉莉，高 雄 ，李 斌,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 廣東廣州 510642；2.廣東省科學(xué)院微生物研究所, 華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室,廣東省微生物安全與健康重點實驗室, 廣東廣州 510070）

免疫調(diào)節(jié)是機體識別和排除抗原性異物，維持自身動態(tài)平衡的生理功能，是各種藥理作用的基礎(chǔ)[1]。而巨噬細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)中重要的效應(yīng)細(xì)胞，被認(rèn)為是評價免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞模型[2]。大量研究證實，真菌多糖是天然的免疫調(diào)節(jié)劑，具有激活巨噬細(xì)胞，治療免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性[3-5]，其生物活性與分子量、單糖組成、糖苷鍵、鏈構(gòu)象等密切相關(guān)[6]。

點柄乳牛肝菌（Suillus granulatus）屬牛肝菌目、乳牛肝菌科、外生菌根真菌，通常與油松共生，廣泛分布于云南、吉林、黑龍江、西藏等地[7]。作為一種味道鮮美的食用菌，其富含多糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，深受世界各地消費者的喜愛。據(jù)民間記載，其還有清熱解毒，治療感冒咳嗽、食積腹脹等功效[8]?，F(xiàn)有的研究已發(fā)現(xiàn)，點柄乳牛肝菌具有抗腫瘤、抗氧化、抗HIV病毒等多種生物活性[9-12]。多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，而普遍研究指出真菌多糖是天然的免疫調(diào)節(jié)劑，但點柄乳牛肝菌目前相關(guān)研究主要集中在生態(tài)學(xué)以及小分子化合物方面，而對其多糖的結(jié)構(gòu)特性和免疫調(diào)節(jié)活性機制還鮮有報道。

為此，本研究從點柄乳牛肝菌中分離純化出SGP3-1和SGP3-2兩種多糖，表征其結(jié)構(gòu)特性，并利用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7模型，闡釋其體外免疫調(diào)節(jié)活性，以期為點柄乳牛肝菌多糖開發(fā)、資源的綜合利用提供一定的科學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

點柄乳牛肝菌 黑龍江省寧安市北域珍奇山林食品有限公司，由廣東省科學(xué)院微生物研究所胡惠萍高級工程師鑒定；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7（活力＞95%） 美國典型培養(yǎng)物保藏中心；杜氏磷酸緩沖液（DPBS）、杜氏改良高糖培養(yǎng)基（DMEM）、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清（FBS）、中性紅（0.33%）、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA緩沖液、Bis-Tris預(yù)制膠、MOPS SDS電泳緩沖液（20×）、轉(zhuǎn)印緩沖液（20×）、預(yù)染蛋白、脫脂奶粉、增強化學(xué)發(fā)光試劑美國Thermo Scientific公司；剛果紅 中國北京索萊寶科技有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（P006） 中國碧云天生物技術(shù)有限公司；5×蛋白上樣緩沖液、10×TBST漂洗液 中國生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8試劑盒、蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑 美國MedChemexpress生物科技公司；一抗 TLR4、TLR2、p-NFκB p65、NFκB p65、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-Akt、GAPDH、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗體 美國Cell Signaling Technology公司；一抗 ERK、p-ERK、Akt 美國Affinity Biosciences公司；IL-6、TNF-αELISA 試劑盒 中國深圳欣博盛生物科技有限公司；DEAE-瓊脂糖凝膠（DEAE-Sepharose Fast Flow）、丙烯葡聚糖凝膠（Sephacryl S-300 HR） 美國 GE Healthcare Life Science公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖、核糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸）、磺胺、牛血清蛋白、N-（1-萘基）乙二胺二鹽堿、脂多糖（LPS） 美國Sigma公司。

BT25S電子天平 瑞士Mettle Toledo公司；Alpha 1-2LD plus 冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Omega-Lum G化學(xué)發(fā)光儀 美國Aplegen公司；BG-Power 600電泳儀 中國北京百晶生物技術(shù)有限公司；U-2910型分光光度計 日本日立有限公司；電轉(zhuǎn)槽美國Bio-Rad公司；UV-2102C紫外可見分光光度計

中國上海尤尼科有限公司；HERA cell 150i CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientific公司；X射線多晶粉末儀 美國Rigaku公司；Vertex70光譜儀、核磁共振波譜儀（Avance II 600 MHz） 德國布魯克公司；金屬浴 中國杭州奧盛儀器有限公司；Milipore-Q超純水機 德國Milipore公司；Agilent 1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 點柄乳牛肝菌多糖的制備

1.2.1.1 點柄乳牛肝菌多糖的提取 參考Yang等的方法[13]，將點柄乳牛肝菌粉碎，稱取100 g過篩80目的粉末，加入2 L 95%乙醇在75 ℃條件下提取2 h，重復(fù) 2次。濾渣干燥后，加入超純水（1:20，w/v）在90 °C下提取2 h，重復(fù)3次。合并3次濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 °C條件下減壓濃縮，濃縮液用4倍體積的無水乙醇混勻后，在4 ℃下靜置16 h后，6000 r/min、15 ℃條件下離心10 min，獲得的沉淀用超純水復(fù)溶，Sevage試劑（氯仿:正丁醇，4:1）除蛋白，將上層多糖溶液用3500 Da的透析袋透析72 h，冷凍干燥，獲得點柄乳牛肝菌粗多糖。

1.2.1.2 點柄乳牛肝菌多糖的分離純化 利用DEAE離子交換柱和葡聚糖凝膠析對點柄乳牛肝菌粗多糖進行分離純化。用8 mL超純水溶解180 mg粗多糖過DEAE-Sepharose fast flow層析柱（2.6 cm×30 cm），采用0～0.5 mol/L NaCl溶液洗脫，流速為2.5 mL/min，苯酚硫酸法檢測洗脫液多糖含量。將0.2 mol/L的多糖組分進一步采用Sephacryl S-300 HR凝膠滲透柱（1.6 cm×50 cm）純化，流速為 1.0 mL/min，苯酚硫酸法檢測洗脫液多糖含量。

1.2.2 點柄乳牛肝菌多糖的結(jié)構(gòu)表征

1.2.2.1 理化成分測定 碳水化合物含量用苯酚-硫酸法測定，取樣品加入6%苯酚和濃硫酸中混勻，冰上靜置3 min，沸水浴10 min，測定490 nm處的吸光值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)[14]。蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測定，按照Bradford蛋白濃度測定試劑盒（P006）說明書進行測定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)[15]。

1.2.2.2 重均分子量測定 參考Liao等的方法[16]，用高效滲透凝膠色譜法分析多糖樣品的重均分子量分布，將多糖樣品與不同重均分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（5.2、11.6、23.8、48.6、148、273、410和 668 kDa）用100 mmol/L NaNO3溶液溶解，設(shè)置柱溫為35 ℃，流速為0.4 mL/min，分析SGP3-1和SGP3-2的重均分子量（Mw）。

1.2.2.3 單糖組成分析 參考Niu等的方法[17]，取2 mg多糖樣品，用1 mL三氟乙酸溶解，100 ℃下水解6 h，然后用0.5 mol/L PMP衍生化。PMP衍生物在Agilent 1200系列HPLC系統(tǒng)（G1322A脫氣器，G1311A Quat泵，G1329A ALS 進樣器，G1315D DAD檢測器）上進行分析，單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖、核糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸）進行同樣處理后上機檢測。

色譜柱：Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm，美國 Agilent公司），檢測溫度：30 ℃，檢測波長：250 nm，流速：0.8 mL/min，流動相：磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH6.5）和乙腈（84:16，v/v）的混合物。

1.2.2.4 傅里葉紅外變換光譜分析 取適量多糖樣品與溴化鉀混合研磨壓片，在Vertex 70光譜儀中進行紅外掃描，掃描波數(shù)范圍為4000～400 cm-1。

1.2.2.5 X-射線衍射分析 根據(jù)Schokker等的方法并加以改進[18]，利用X射線多晶粉末儀分析多糖樣品的X射線衍射圖譜，設(shè)定條件為：管流40 mA，管壓 40 kV，速率 5°/min，2θ 角掃描范圍在 10°～90°。

1.2.2.6 剛果紅實驗 參考Hu等的方法[19]，取0.25 mL多糖溶液（1 mg/mL）與 0.5 mL 剛果紅（80 μmol/L）混合，滴加0.25 mL NaOH溶液，使其終濃度依次為0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mol/L，反應(yīng)體系避光放置10 min后，U-2910分光光度計測定反應(yīng)溶液的最大吸收波長，對照組以超純水替代多糖溶液。

1.2.2.7 核磁共振波譜分析 取40 mg多糖樣品溶解于0.5 mL氘代水中，使用600 MHz核磁共振光譜儀記錄1H-NMR和13C-NMR。

1.2.3 SGP3-1和SGP3-2的免疫調(diào)節(jié)活性研究

1.2.3.1 細(xì)胞增殖活性測定 將RAW264.7細(xì)胞（2.5×105個/mL）接種到96 孔板，每孔200 μL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，小心棄去舊培養(yǎng)液，加入用含血清培養(yǎng)基溶解的不同濃度多糖溶液（5、10、20、40、80、160 μg/mL）及陽性對照 LPS（100 ng/mL），處理24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，參考試劑盒說明書，每孔加入200 μL含CCK8的無血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光值。

1.2.3.2 細(xì)胞吞噬活性測定 細(xì)胞培養(yǎng)、接種方式同1.2.2.1，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 h，加入不同濃度多糖溶液（5、10、20、40 μg/mL）及LPS（100 ng/mL）。處理24 h后，小心吸出舊培養(yǎng)基，加入100 μL DPBS配制的中性紅溶液（0.1%），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，吸除上清，DPBS洗板3次，加入100 μL冰乙酸-無水乙醇混合溶液（1:1，v/v）裂解細(xì)胞，25 ℃ 靜置 2 h 后，酶標(biāo)儀測量540 nm處的吸光值。

1.2.3.3 NO、TNF-α及IL-6含量測定 將RAW264.7細(xì)胞（5×105個/mL）接種到96孔板中，加樣方式同1.2.2.2，與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清液，根據(jù)Griess試劑法測定細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽含量，反映NO的產(chǎn)生量，按照ELISA試劑盒說明書，測定細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的含量。

1.2.3.4 Western blot檢測免疫調(diào)節(jié)信號通路相關(guān)蛋白 將RAW264.7細(xì)胞（5×105個/mL）接種到60 mm的培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，對照組僅加入培養(yǎng)基，其他各組分別加入SGP3-1（40 μg/mL）、SGP3-2（40 μg/mL）以及LPS（100 ng/mL）樣品，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 30 min，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑）充分裂解細(xì)胞，14000 ×g離心10 min，吸取上清即為細(xì)胞總蛋白，按照美國Thermo Scientific公司的Pierce BCA蛋白檢測試劑盒說明書測定總蛋白含量，將細(xì)胞總蛋白與上樣緩沖液按4:1的體積比混合，金屬浴95 ℃加熱10 min，冷卻后，取40 μg蛋白樣品在Bis-Tris聚丙烯酰胺凝上電泳（200 V，50 min），將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1 h，置于一抗（p-NFκB p65、NFκB p65、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、GAPDH）中 4 ℃ 孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，最后通過ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，Omega Lum G成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 所有實驗平行3次，重復(fù)2～3次，圖表數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin 9.0軟件繪圖，F(xiàn)luorChem 5500進行蛋白條帶光密度值分析，SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行ANOVA方差分析，P＜0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 點柄乳牛肝菌多糖的制備

經(jīng)過系列提取分離后，利用Sephacryl S-300 HR凝膠柱進一步純化SGP3，由圖1可知，Sephacryl S-300 HR凝膠柱洗脫后出現(xiàn)兩個多糖峰，依次命名為 SGP3-1、SGP3-2。

圖1 SGP3-1和SGP3-2的Sephacryl S-300 HR柱洗脫圖Fig.1 Elution diagram of Sephacryl S-300 HR column of SGP3-1 and SGP3-2

2.2 SGP3-1和SGP3-2的結(jié)構(gòu)特性分析

2.2.1 SGP3-1和SGP3-2的理化成分及重均分子量分析 經(jīng)苯酚硫酸法、考馬斯亮藍(lán)法測定分離得到的點柄乳牛肝菌多糖SGP3-1和SGP3-2的理化特性組成，經(jīng)高效滲透凝膠色譜法測定SGP3-1和SGP3-2的分子量分布情況如表1所示。點柄乳牛肝菌分離純化的SGP3-1和SGP3-2多糖含量相似，且其蛋白質(zhì)含量極少，說明蛋白質(zhì)幾乎被去除。HPGPC法測得SGP3-1和SGP3-2的重均分子量分別為170.48和14.52 kDa，表明SGP3中含有兩個不同重均分子量的均一多糖組分。

表1 SGP3-1和SGP3-2的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of SGP3-1 and SGP3-2

2.2.2 SGP3-1和SGP3-2的單糖組成分析 本實驗利用PMP柱前衍生法測定2個多糖組分的單糖組成，從圖2可以看出，SGP3-1主要由葡萄糖（55.47%）、甘露糖（20.63%）和半乳糖（14.04%）組成；SGP3-2主要由葡萄糖（82.43%）和甘露糖（7.45%）組成，表明SGP3-1和SGP3-2的主要單糖組成均為葡萄糖，但二者的單糖組成及其摩爾比存在差異。另外，SGP3-1和SGP3-2的葡萄糖醛酸含量分別為2.34%和5.28%，說明二者是酸性多糖。

圖2 單糖組成液相色譜圖Fig.2 Monosaccharide composition liquid chromatogram analyzed by HPLC

2.2.3 SGP3-1和SGP3-2的紅外光譜分析 利用傅里葉紅外光譜分析多糖的官能團及糖苷鍵組成。如圖3所示，SGP3-1和SGP3-2的主要特征吸收峰基本一致，3392.14 cm-1為氫鍵締合的羥基伸縮振動吸收峰，2922.07 cm-1是由CH3或CH2的C-H鍵伸縮振動所致[20]，1724.43和1615.14 cm-1可能分別為羧酸基和結(jié)合水的特征吸收峰[21-22]，SGP3-2在1724.43 cm-1處的吸收強度高于SGP3-1，說明SGP3-2的糖醛酸含量高于SGP3-1，這與單糖組成分析結(jié)果一致。1000～1200 cm-1范圍內(nèi)的三個特征吸收峰1161.28、1074、1045 cm-1表明存在吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)[23-24]，在 900.43和 825.43 cm-1分別為β-糖苷鍵和α-糖苷鍵的特征吸收峰，表明SGP3-1結(jié)構(gòu)以α-糖苷鍵為主，而 SGP3-2以β-糖苷鍵為主[25-26]。上述官能團分析結(jié)果說明SGP3-1和SGP3-2具有典型的多糖結(jié)構(gòu)特征。

圖3 SGP3-1和SGP3-2的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of SGP3-1 and SGP3-2

2.2.4 SGP3-1和SGP3-2的晶型分析 利用X-射線衍射分析多糖的晶體構(gòu)型，結(jié)果如圖4所示。SGP3-1和SGP3-2的X射線衍射強度曲線基本一致，在2θ角為20°附近出現(xiàn)較弱且峰型圓鈍的衍射峰，說明這兩種多糖均以非定型的結(jié)晶態(tài)存在。SGP3-1和SGP3-2的晶型結(jié)構(gòu)推測是由于多糖結(jié)構(gòu)屬于柔性結(jié)構(gòu)，因而不易形成單晶[27]。

圖4 SGP3-1和SGP3-2的X射線衍射圖Fig.4 XRD spectra of SGP3-1 and SGP3-2

2.2.5 SGP3-1和SGP3-2的剛果紅分析 利用剛果紅試劑分析多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)，在一定NaOH濃度范圍內(nèi)，剛果紅可與具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖形成絡(luò)合物，與剛果紅溶液相比，絡(luò)合物的最大吸收波長發(fā)生紅移，以此可鑒定多糖中是否存在三螺旋結(jié)構(gòu)。如圖5所示，隨著NaOH濃度的增加，剛果紅與SGP3-1或SGP3-2混合溶液的最大吸收波長均逐漸降低，與未添加多糖的剛果紅溶液空白組下降趨勢相同，說明這兩種多糖與剛果紅溶液反應(yīng)后未發(fā)生紅移現(xiàn)象，可推測SGP3-1和SGP3-2不存在三螺旋結(jié)構(gòu)。先前研究者報道的猴頭菇多糖、黑木耳多糖、杏鮑菇多糖等食用菌多糖中[24,28]，同樣不具有三螺旋結(jié)構(gòu)，但仍具有較強的生物活性。

圖5 剛果紅及其多糖復(fù)合物在不同濃度NaOH下的最大吸收波長Fig.5 Maximum absorption wavelength of Congo redpolysaccharide complex and Congo red at different concentrations of NaOH

2.2.6 SGP3-1和SGP3-2核磁共振波譜分析 由圖6可知，在SGP3-1和SGP3-2的一維核磁（1H和13C）光譜圖中，化學(xué)位移主要集中在δH3.0～5.6和δC60.0～110.0 ppm，屬于多糖信號峰。兩種多糖在δH4.3～5.6和δC97.0～105.0 ppm出現(xiàn)的異頭信號表明均存在α-和β-構(gòu)型的糖苷鍵[21]。一般來說，不規(guī)則質(zhì)子殘留在5.00 ppm以上的質(zhì)子，在α構(gòu)型中有化學(xué)置換，而低于5.00 ppm的質(zhì)子，在β構(gòu)型中有化學(xué)置換[29]。從1H-NMR光譜圖可以看出，SGP3-1在δH5.0～5.5 ppm出現(xiàn)的異頭質(zhì)子信號較強，而SGP3-2在δH4.3～5.0 ppm出現(xiàn)的異頭質(zhì)子信號較強，說明SGP3-1以α構(gòu)型糖基為主，而SGP3-2以β構(gòu)型糖基為主。從13C-NMR光譜圖可以看出，兩種多糖的糖苷鍵異頭碳信號出現(xiàn)在δC97.0～103.5 ppm，糖苷鍵的其他碳信號出現(xiàn)在δC60～80 ppm，在δC170.0～180.0 ppm范圍內(nèi)均有一個糖醛酸信號吸收峰，說明SGP3-1和SGP3-2都是酸性多糖[30]。這些結(jié)果與紅外光譜、單糖組成的結(jié)果相一致。兩種多糖在δH1.1～1.3和δC16.0～18.0 ppm出現(xiàn)的信號屬于甲基碳的化學(xué)位移。此外，δ2.06/22.46 ppm處的化學(xué)位移表明SGP3-2中存在N-乙?；盘朳31]。

圖6 SGP3-1和SGP3-2的核磁共振波譜Fig.6 NMR spectra of SGP3-1 and SGP3-2

2.3 SGP3-1和SGP3-2的免疫調(diào)節(jié)活性

2.3.1 SGP3-1和SGP3-2對RAW264.7細(xì)胞增殖能力的影響 為確定SGP3-1和SGP3-2對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響，本研究采用CCK-8法測定多糖樣品處理后的細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖7。與對照組相比，SGP3-1在5～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)可促進RAW264.7細(xì)胞增殖，隨著濃度增加，當(dāng)其濃度高于80 μg/mL時，細(xì)胞存活率低于100%，有一定細(xì)胞毒性作用，而 SGP3-2在5～160 μg/mL濃度范圍內(nèi)均能促進RAW264.7細(xì)胞增殖，無細(xì)胞毒性。為對比SGP3-1和SGP3-2的免疫調(diào)節(jié)活性，選擇5～40 μg/mL安全濃度范圍開展后續(xù)實驗。

圖7 SGP3-1和SGP3-2處理對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.7 Effects of SGP3-1 and SGP3-2 treatment on the viability of RAW264.7 cells

2.3.2 SGP3-1和SGP3-2對RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的影響 為評價SGP3-1和SGP3-2處理對RAW 264.7細(xì)胞吞噬作用的影響，本研究通過測定RAW264.7細(xì)胞對中性紅的攝入量來反映吞噬能力。中性紅是一種酸堿指示劑，通過胞吞作用攝入細(xì)胞內(nèi)，因此能通過中性紅攝入量的多少，反映巨噬細(xì)胞吞噬活性的大小[32]，結(jié)果如圖8所示。與對照組相比，SGP3-1和 SGP3-2在 5～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)能顯著促進RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅的能力（P＜0.05）。SGP3-1的促進作用隨著處理濃度提高而增強，而SGP3-2 在 20 μg/mL 時，吞噬能力最強，40 μg/mL 濃度下吞噬能力則有所減弱，但與陽性對照LPS組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），表明SGP3-1和SGP3-2均能增強細(xì)胞吞噬能力，激活巨噬細(xì)胞RAW264.7。

圖8 SGP3-1和SGP3-2處理對RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響Fig.8 Effects of SGP3-1 and SGP3-2 treatment on the phagocytic capacity of neutral red in RAW264.7 cells

2.3.3 SGP3-1和 SGP3-2對 RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α及IL-6的 影響 為評價SGP3-1、SGP3-2處理對RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α及IL-6的影響，本研究采用Griess試劑法測定NO含量，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6含量，結(jié)果如圖9所示。NO作為一種重要的信號傳導(dǎo)介質(zhì)，參與多種生理活動和病理過程，在免疫調(diào)節(jié)方面是不可或缺的調(diào)節(jié)因子，TNF-α和IL-6的分泌可激活免疫細(xì)胞而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，增強機體的抵抗力[33-34]。在5～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)，SGP3-1和SGP3-2均可顯著促進RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α及IL-6，且隨著多糖處理濃度的增加，產(chǎn)生量隨之增加。在同一作用濃度下，SGP3-2對NO、TNF-α及IL-6產(chǎn)生的促進作用顯著強于SGP3-1。說明SGP3-1和SGP3-2可通過刺激 RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生 NO，分泌 TNF-α、IL-6。

圖9 SGP3-1和SGP3-2處理對RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α及IL-6的影響Fig.9 Effects of SGP3-1 and SGP3-2 treatment on the production of NO 、TNF-α and IL-6 in RAW264.7 cells

2.3.4 SGP3-1 和SGP3-2 對MAPKs、PI3K/Akt和NF-κB信號通路的影響 為探究MAPKs、PI3K/Akt和NF-κB這三條信號通路是否參與免疫反應(yīng)，采用Western blot法檢測通路相關(guān)蛋白磷酸化水平。如圖10所示，與對照組相比，SGP3-1和SGP3-2處理能夠顯著提高p-Akt蛋白的表達量（P＜0.05），分別為對照組的 3.29和 4.14倍。同樣地，40 μg/mL的SGP3-1和 SGP3-2處理，能顯著提高 JNK、ERK、p38蛋白的磷酸化水平，當(dāng)SGP3-1處理后，p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表達量分別為對照組的4.30、4.70、7.37倍，SGP3-2處理后，p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表達量分別為對照組的5.48、6.27、9.06倍。而 SGP3-1和 SGP3-2分別顯著提高了 p-NF-κB p65蛋白的表達量至對照組的2.67和3.79倍。

近年來，PI3K/Akt信號通路在免疫系統(tǒng)中起到的重要作用受到了廣泛關(guān)注，它參與增殖、分化、吞噬、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，而Akt是該通路的中心和下游效應(yīng)分子[35]。MAPKs家族主要包含三條信號途徑：JNK、ERK和p38，前人研究指出LPS、細(xì)胞因子、多數(shù)真菌多糖可通過MAPKs信號通路，激活巨噬細(xì)胞[36-37]。另外，PI3K/Akt已被證實能夠調(diào)控MAPKs信號通路[38]。在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)方面，NF-κB是一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)下游炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，在巨噬細(xì)胞活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[39]，PI3K/Akt和MAPKs信號途徑被認(rèn)為與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化有關(guān)。綜上可知，SGP3-1和SGP3-2可通過活化MAPKs、PI3K/Akt和NF-κB信號通路而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

結(jié)合上述結(jié)果推測，SGP3-1和SGP3-2通過調(diào)控PI3K/Akt/MAPKs信號途徑，活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，促進細(xì)胞因子或NO產(chǎn)生，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。另外，由圖10可知，SGP3-2對 Akt、JNK、ERK、p38以及NF-κB p65蛋白的磷酸化作用均顯著強于SGP3-1，這與 NO、細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6）測定結(jié)果一致。Ferreira等[40]指出，多糖的免疫調(diào)節(jié)活性與其結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān)，由此推測，SGP3-1與SGP3-2免疫調(diào)節(jié)活性的差異可能與單糖組成、分子量以及糖苷鍵類型的不同有關(guān)[41]。推測其原因是SGP3-2的分子量小于SGP3-1，溶解度高，更有利于其在體內(nèi)發(fā)揮活性，且SGP3-1以α-糖苷鍵為主，而SGP3-2以β-糖苷鍵為主，已有研究指出β-糖苷鍵的多糖具有更強的生物活性。

圖10 SGP3-1和SGP3-2處理對RAW264.7細(xì)胞MAPKs、PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig.10 Effects of SGP3-1 and SGP3-2 treatment on the protein expression level of MAPKs、PI3K/Akt and NF-κB signaling pathway in RAW264.7 cells

3 結(jié)論

SGP3-1、SGP3-2的重均分子量分別為170.48和14.52 kDa，具有典型的多糖官能團，不含三螺旋結(jié)構(gòu)，且為無定形態(tài)。SGP3-1以α-糖苷鍵為主，單糖組成以葡萄糖（55.47%）、甘露糖（20.63%）及半乳糖（14.04%）為主；而SGP3-2以β-糖苷鍵為主，單糖組成以葡萄糖（82.43%）為主。SGP3-1和SGP3-2可通過激活MAPKs和PI3K/Akt信號通路，活化轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB，增強 RAW264.7細(xì)胞吞噬活性，促進NO、TNF-α及 IL-6產(chǎn)生，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，且SGP3-2的免疫調(diào)節(jié)活性強于SGP3-1。綜上所述，SGP3-1和SGP3-2具有免疫調(diào)節(jié)活性，可用于開發(fā)功能性食品，作為免疫力低下人群的膳食補充劑。同時，本研究也為點柄乳牛肝菌的進一步開發(fā)提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。