金花茶多糖的體外消化及酵解特性研究

龔 雯，唐 婕，韋雅淵，寧恩創(chuàng), ，韋 璐

（1.廣西大學輕工與食品工程學院, 廣西南寧 530004；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院, 廣西南寧 530007）

多糖是一類廣泛存在于多種動植物及微生物中的生物大分子，通常由10個以上的單糖通過糖苷鍵鏈接而成[1]。多糖作為具有天然活性的高分子聚合物，如何被人體消化及利用以發(fā)揮其功能活性逐漸成為近年來多糖領域的研究熱點。由于內(nèi)窺鏡[2]、磁共振成像[2]、動物模型[3]等體內(nèi)研究價格昂貴且探索范圍有限，體外消化模型和糞便酵解方法的建立能夠更簡便、更可控、更直觀地展現(xiàn)食物消化及吸收過程。研究表明，非淀粉類多糖并不會被唾液降解，部分植物多糖會在胃液、腸液中部分降解[4-7]。因此，這類多糖能夠較為完整地通過消化系統(tǒng)到達大腸，且腸道微生物能夠較完全地利用多糖，從而促進益生菌增殖、抑制致病菌生長，并產(chǎn)生對人體有益的短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids, SCFAs）[8]。SCFAs 對人體具有諸多功能作用，不僅能被腸道上皮細胞提供能量，維持電解質(zhì)平衡[9]，還具有抗炎[10]、預防肥胖[11]、預防糖尿病[12]、預防非酒精性脂肪肝[13]、預防結(jié)腸癌[14]等重要作用。

金花茶（Camellia nitidissimaChi）屬山茶科山茶屬，是我國特有屬種的植物，主要分布于廣西壯族自治區(qū)防城港市[15]。研究表明，金花茶多糖具有護肝[16]、降血脂[17]、抗氧化活性[18]等功能活性。目前，尚未有對金花茶多糖體外消化及酵解特性的研究報道。多糖結(jié)構(gòu)的完整性是多糖在大腸中發(fā)揮功能活性的基礎，而腸道微生物對多糖的分解是人體利用多糖的重要途徑。因此，研究金花茶多糖的消化及酵解對金花茶功能作用的發(fā)揮尤為重要。本文建立了體外消化模型及人體糞便酵解方法，探討分級純化后的金花茶多糖體外消化及酵解特性，旨在為金花茶多糖益生元產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金花茶葉干制品 廣西桂人堂金花茶產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司提供；無水乙醇 成都市科隆化學品有限公司；唾液淀粉酶（1000 U/mg）、胃蛋白酶（500 U/mg）、胰蛋白酶（200 U/mg） 西格瑪奧德里奇有限公司；乙酸、丙酸、丁酸標準品 色譜純，西格瑪奧德里奇有限公司；單糖標準品（甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖） 色譜純，西格瑪奧德里奇有限公司；葡聚糖標準品（MW1000、MW5000、MW12000、MW25000、MW80000、 MW150000、 MW270000、 MW410000、MW670000） 色譜純，西格瑪奧德里奇有限公司；3,5-二硝基水楊酸、膽鹽、偏磷酸 上海源葉生物科技有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基 索萊寶科技有限公司；厭氧袋、厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧指示劑 日本三菱氣體化學株式會社；新鮮糞便 源自6名身體健康、年齡在20～25之間、沒有消化疾病、三個月內(nèi)沒有服用過抗生素的志愿者（3名女性、3名男性）；所有分離用有機溶劑 均為國產(chǎn)分析純。

HC-3108R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；TLE204E型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；ST3100型pH計 奧豪斯儀器（常州）有限公司；光柵型多功能微孔板檢測儀（酶標儀） 奧地利TECAN公司；HPP-9272型恒溫培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Agilent 7980B型氣象色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金花茶多糖提取工藝 將金花茶干葉制品剪切碾碎，熱水浸提后（料液比1:55，時間2.5 h，溫度92 ℃），旋蒸儀濃縮（濃縮比10:1），以4倍體積無水乙醇醇沉處理。將醇沉后的樣品離心（8500 r/min，15 min），取沉淀加水復溶得到金花茶粗多糖溶液，旋蒸儀懸蒸去除溶液中殘留的乙醇，并采用Sevage試劑脫除游離蛋白，采用聚酰胺樹脂吸附脫色。將處理后的樣品溶液離心（8500 r/min，15min），取上清液透析后冷凍干燥，得到金花茶粗多糖，備用。

1.2.2 金花茶多糖的分離純化

1.2.2.1 金花茶多糖DEAE-52纖維素柱層析 參照田曉春[19]的方法并稍作修改。將150 mg金花茶粗多糖溶于10 mL超純水中，離心后取上清液沿壁加入2.6 cm×60 cm的DEAE-52 纖維素層析柱中，依次采用去離子水，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 的NaCl溶液依次進行梯度洗脫，并采用苯酚硫酸法[20]測定其吸光度，以管數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線。收集同一峰洗脫液，濃縮后透析并凍干，獲得純化后的金花茶多糖級分，并計算回收率?；厥章视嬎愎饺缦拢?/p>

式中：C表示回收率，%；m表示回收樣品質(zhì)量，g；M 表示上樣量，g。

1.2.2.2 金花茶多糖的理化指標分析 參照鄭朋朋等[20]的方法，采用苯酚硫酸法測定總糖含量；參照王佳等[21]的方法，采用硫酸咔唑法測定糖醛酸含量；參照王艾平[22]的方法，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量；參照夏甜天等[23]的方法，采用福林酚法測定多酚含量；參照李環(huán)等[24]的方法，采用DNS法測定還原糖含量。

1.2.2.3 金花茶多糖的分子量測定和單糖測定 參照賈金霞等[25]的方法，采用高效凝膠色譜法測定金花茶多糖的分子量。色譜條件如下：色譜柱為TSKgel G400PWXL，檢測器為RID-10A示差檢測器，柱溫為常溫，流動相為超純水，流速為0.5 mL/min。參照王貴春等[26]的方法，采用PMP柱前衍生高效液相色譜法檢測單糖組成。色譜條件如下：色譜柱為VenusilMP-C18，采用Agilent 1200色譜系統(tǒng)，測定波長為250 nm，柱溫為30 ℃，流量為1 mL/min，流動相為 0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖劑乙腈（83:17，v/v），樣本數(shù)量為15 μL，持續(xù)時間為80 min。

1.2.3 金花茶多糖的體外消化 體外消化模型與模擬消化液的配制參照文獻[27]方法建立。取冷凍干燥后的金花茶多糖樣品配置成1 mg/mL的溶液50 mL備用。

1.2.3.1 模擬口腔消化 取5 mL多糖溶液與模擬唾液按比例1:1在試管中混合（wt/wt），將試管與厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧指示劑一并放入?yún)捬醮?，密封并用封口夾封口。無氧條件下厭氧指示劑呈粉紅色。避光培養(yǎng)5 min（37 ℃, pH7.0），取樣品檢測多糖分子量、還原糖含量及游離單糖。

1.2.3.2 模擬胃消化 將模擬唾液消化后的消化產(chǎn)物與模擬胃液按比例1:1混合（wt/wt），按1.2.3.1相同條件，避光培養(yǎng) 2 h（37 ℃，pH3.0）。取樣品檢測多糖分子量、還原糖含量及游離單糖。

1.2.3.3 模擬小腸消化 將模擬胃液消化后的消化產(chǎn)物與模擬腸液按比例1:1混合（wt/wt），按1.2.3.1相同條件，避光培養(yǎng) 2 h（37 ℃，pH7.0），取樣品檢測多糖分子量、還原糖含量及游離單糖。

1.2.4 金花茶多糖的體外發(fā)酵

1.2.4.1 腸菌液制備 將收集的糞便混合均質(zhì)，添加10倍體積磷酸緩沖液（1 mmol/L，pH7.0）充分混合，過濾并收集濾液，備用。

1.2.4.2 配制發(fā)酵培養(yǎng)基 基礎發(fā)酵液配制參照Ramnani等[28]的方法，調(diào)配完成的培養(yǎng)基超聲溶解后，裝入錐形瓶中高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 體外發(fā)酵 參照Olano等[29]的方法并稍作修改。取0.5 mL腸菌液加入到10 mL基礎培養(yǎng)基，添加15 mg/mL的金花茶多糖溶液1 mL，混勻后與厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧指示劑一同放入?yún)捬醮?，厭氧指示劑呈密封并用封口夾封口，無氧條件下厭氧指示劑呈粉紅色。 37 ℃培養(yǎng)，并作不添加多糖的空白對照組，發(fā)酵 0、6、12、18、24、36、48 h后，依次取出厭氧培養(yǎng)皿，加入 20 g/L CuSO475 μL 終止發(fā)酵，-80 ℃低溫保存，并測定體外發(fā)酵過程中的pH、總糖含量及糖消耗率、還原糖含量、SCFAs含量以及乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌的菌落總數(shù)變化。

1.2.5 體外發(fā)酵實驗中指標的測定

1.2.5.1 pH測定 將酵解不同時間的酵解液混勻，在冰水浴中測定pH。

1.2.5.2 總糖含量及糖消耗率測定 方法同章節(jié)1.2.2.2。糖消耗率計算公式如下：

式中：w表示糖消耗率，%；C1表示初始總糖濃度，mg/mL;C2表示某時刻總糖濃度，mg/mL。

1.2.5.3 SCFAs含量測定 參考耿梅梅等[30]的方法，并稍作修改。取2 mL酵解產(chǎn)物12000 r/min離心 15 min，加入 0.25 mL的 25%偏磷酸溶液，過0.22 μm有機相濾膜后，使用氣相色譜儀檢測SCFAs含量。條件如下：色譜柱為DB-FFAP，進樣量1 μL，分流比 20:1，進樣口溫度 250 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度280 ℃，程序升溫起始溫度60 ℃，升溫速度以20 ℃·min-1速率升溫至 220 ℃ 且保持 6 min，載氣為高純氮氣（99.999%），流速0.8 mL/min。

1.2.5.4 乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌的菌落計數(shù)配制MRS瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基分別用于培養(yǎng)乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌。將酵解產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)，取50 μL置于培養(yǎng)基中，用涂布棒使其均勻分布，在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h后使用平板計數(shù)法統(tǒng)計菌落數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 金花茶多糖的分離純化

通過DEAE-52纖維素柱層析分離金花茶多糖，得到洗脫曲線圖1，可知去離子水洗脫的TPS1、0.2 mol/L NaCl溶液洗脫的TPS2、0.3 mol/L NaCl溶液洗脫的TPS3比例較高。由表1可知，TPS1、TPS2和TPS3的回收率分別為5.85%、29.03%、34.67%。經(jīng)純化后，三種多糖級分蛋白質(zhì)、多酚、還原糖含量都較低。TPS3糖醛酸含量最高，TPS2次之；TPS1中性糖含量較高，糖醛酸含量最低。這可能是因為洗脫溶液NaCl濃度越高，得到的金花茶多糖含有更多的硫酸基、羧基等，糖醛酸含量也更高[31-32]。由表2可知，TPS1主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，是具有兩種多糖混合的雜多糖，分子量分別為15.57×104、1.04×104Da；TPS2、TPS3 主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖組成，分子量分別為42.29×104、66.68×104Da。由于TPS1是雜多糖且難以另外分離純化，后續(xù)關于TPS1的實驗皆采用混合多糖的形式進行，除分子量外不對單獨組分作相關分析。

表1 TPS1、TPS2和TPS3的回收率及化學組成Table 1 Recovery and chemical composition of TPS1, TPS2 and TPS3

表2 TPS1，TPS2和TPS3的分子量及單糖組成Table 2 Molecular weight and monosaccharide composition of TPS1, TPS2 and TPS3

圖1 金花茶粗多糖的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of polysaccharides from Camellia nitidissima Chi

2.2 體外消化對金花茶多糖的影響

2.2.1 消化產(chǎn)物中金花茶多糖的分子量分析 由圖2～圖4可知，模擬口腔、模擬胃、模擬小腸消化前后，盡管峰形不完全相同，但出峰時間幾乎沒有變化。由表3可知，模擬口腔和模擬小腸消化前后，TPS1、TPS2和TPS3的相對分子質(zhì)量均未產(chǎn)生變化；而模擬胃消化前后，混合雜多糖TPS1的兩個多糖組分的分子量，以及TPS2和TPS3的分子量從15.57×104、1.04×104、42.29×104、66.68×104Da 變?yōu)?15.09×104、0.92×104、41.33×104、65.26×104Da。可知模擬胃液對金花茶多糖具有一定降解作用，但降解程度不高。研究表明，較低的pH可能會造成多糖的降解和斷裂[33]，這可能是模擬胃液致使多糖分子量降低的原因之一。

表3 TPS1、TPS2和TPS3消化前后的分子量變化表Table 3 Molecular weight of TPS1, TPS2 and TPS3 before and after digestion

圖2 消化前后TPS1的GPC分析圖譜Fig.2 GPC elution profile of TPS1 before and after digestion

圖3 消化前后TPS2的GPC分析圖譜Fig.3 GPC elution profile of TPS2 before and after digestion

圖4 消化前后TPS3的GPC分析圖譜Fig.4 GPC elution profile of TPS3 before and after digestion

2.2.2 消化產(chǎn)物中還原糖含量分析 如表4所示，三種金花茶多糖級分在模擬口腔和模擬小腸消化前后，消化產(chǎn)物中還原糖含量基本沒有變化。而經(jīng)模擬胃消化前后，TPS1、TPS2和TPS3消化產(chǎn)物中還原糖含量由0.129±0.016、0.155±0.026、0.147±0.017 mmol/L 增加為0.223±0.018、0.319±0.013、0.294±0.030 mmol/L。還原糖含量的增加說明金花茶多糖的部分糖苷鍵斷裂，更多的還原末端暴露[34]。可知模擬唾液、模擬腸液不能消化金花茶多糖，而胃液能夠部分消化金花茶多糖，這與分子量測定結(jié)果一致。

表4 TPS1、TPS2和TPS3消化前后的還原糖含量變化表Table 4 Reducing sugar content of TPS1, TPS2 and TPS3 before and after digestion

2.2.3 消化結(jié)束后游離單糖含量分析 圖5為單糖標準品的HPLC圖譜，圖6為添加了TPS1、TPS2和TPS3的體外消化組以及空白對照組在消化結(jié)束后的單糖釋放情況。由空白對照組的HPLC圖譜可知，模擬消化液中并沒有碳水化合物。而三種金花茶多糖級分的HPLC色譜圖中，只有溶劑峰，且與空白對照組出峰時間一致，且皆未檢測出單糖組分。這與閔芳芳等[35]關于青錢柳多糖的體外消化研究結(jié)果一致。

圖5 8種單糖PMP衍生物的HPLC圖譜Fig.5 Chromatogams of PMP derivatives of eight kinds of monosaccharides by HPLC

圖6 金花茶多糖體外模擬消化結(jié)束后PMP衍生物的HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatogram of PMP derivatives after simulated digestion of Camellia polysaccharide in vitro

2.3 糞便酵解對金花茶多糖的影響

2.3.1 酵解過程中pH的變化 如圖7所示，酵解期間（0～48 h），空白對照組的pH呈現(xiàn)先降低后略微升高的趨勢。與空白對照組不同，添加了TPS1、TPS2和TPS3的酵解組的pH在酵解期間分別從7.54、7.56、7.50降低至 5.84、5.72、5.66。TPS3酵解組的pH下降程度要略大于TPS2與TPS1。pH呈弱酸性與微生物代謝產(chǎn)生SCFAs有關[36]?？芍c道菌群能夠利用金花茶多糖，從而代謝產(chǎn)生大量SCFAs，使得酵解產(chǎn)物呈弱酸性。而TPS3相較TPS2與TPS1，促進SCFAs產(chǎn)生的作用更佳。

圖7 TPS1、TPS2和TPS3對酵解液pH的影響Fig.7 Effect of TPS1, TPS2 and TPS3 on pH of fermentative liquid

2.3.2 酵解過程中總糖和還原糖含量的變化 如圖8、圖9 所示，酵解期間（0～48 h），添加了 TPS1、TPS2和TPS3的酵解組總糖含量分別從0.85、0.83、0.89 mg/mL 降低至 0.073、0.091、0.049 mg/mL，總糖消耗率分別為91.4%、89.0%、94.5%；而還原糖含量在0～18 h期間分別從 0.091、0.089、0.098 mg/mL 增加至 0.36、0.41、0.46 mg/mL，后在 18～48 h期間降低0.051、0.084、0.040 mg/mL?？偺呛拷档驼f明腸道菌群將金花茶多糖逐步分解吸收；還原糖含量前期增高可能是由于菌群降解多糖導致糖苷鍵被破壞，更多還原末端被釋放出來；而后期這些短鏈還原糖又被菌群逐步分解利用，導致還原糖含量降低[37-38]。

圖8 酵解產(chǎn)物中總糖含量變化Fig.8 Changes in total sugar content in fermentative products

圖9 酵解產(chǎn)物中還原糖含量變化Fig.9 Changes in reducing sugar content in fermentative products

2.3.3 酵解過程中SCFAs含量的變化 表5為標準溶液中SCFAs的標準曲線。表6～表9分別為空白對照組及添加了TPS1、TPS2和TPS3的酵解液中SCFAs濃度變化。酵解期間（0～48 h），TPS1、TPS2和TPS3酵解液中乙酸濃度分別從2.26±0.11、2.22±0.21、2.31±0.39 mmol/L 增加至 18.01±0.67、24.11±0.84、29.28±1.37 mmol/L，是對照組的 4.1、5.5、6.7倍；丙酸濃度分別從 1.38±0.09、1.40±0.17、1.38±0.28 mmol/L 增加到 8.71±0.44、10.91±0.66、12.61±0.96 mmol/L，是對照組的3.7、4.7、5.4倍；丁酸濃度分別從 0.69±0.04、0.71±0.10、0.71±0.09 mmol/L 增加到 2.63±0.20、3.70±0.88、4.83±0.86 mmol/L，是對照組的2.3、3.2、4.2倍?？芍琓PS1、TPS2和TPS3均能促進腸道菌群分解并產(chǎn)生SCFAs，且乙酸含量增加最多；另外，TPS3相較TPS1和TPS2，能夠更好地促使腸道菌群產(chǎn)生更多的SCFAs。

表5 標準溶液中SCFAs的標準曲線Table 5 Calibration curves of different SCFAs in standard solution

表6 空白對照組酵解產(chǎn)物中SCFAs含量變化Table 6 Changes of SCFAs content in fermentation products in blank control group

表9 TPS3組酵解產(chǎn)物中SCFAs含量變化Table 9 Changes of SCFAs content in fermentation products in TPS3 group

2.3.4 酵解過程中乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌的數(shù)量變化 表10～表13分別為空白對照組及添加了TPS1、TPS2和TPS3的酵解液中乳酸菌、雙歧桿菌、大腸桿菌的菌落總數(shù)變化。酵解期間（0～48 h），TPS1、TPS2和TPS3組的乳酸菌數(shù)量分別增加了550、1513、2884倍；雙歧桿菌數(shù)量分別增加了372、1348、1905倍；大腸桿菌數(shù)量分別減少為原來的72%、54%、32%?？芍?TPS1、TPS2和 TPS3均可促使乳酸菌和雙歧桿菌增殖，并抑制大腸桿菌生長。研究表明，多糖中的半乳糖醛酸能夠促進乳酸菌、雙歧桿菌等腸道有益菌群的繁殖，從而產(chǎn)生更多的SCFAs，尤其是乙酸[39]；而SCFAs濃度的增加降低了腸道環(huán)境的pH，較低的pH能夠在一定程度上抑制大腸桿菌等致病菌的生長[40]。這可能是TPS3相較TPS2、TPS1，具有更好益生作用的原因之一。

表10 空白組酵解不同時間酵解液中三種腸道菌菌落總數(shù)變化Table 10 Changes in the total number of three intestinal bacteria colonies in the yeast solution at different time of blank control group

表13 TPS3組酵解不同時間酵解液中三種腸道菌菌落總數(shù)變化Table 13 Changes in the total number of three intestinal bacteria colonies in the yeast solution at different time of TPS3 group

表7 TPS1組酵解產(chǎn)物中SCFAs含量變化Table 7 Changes of SCFAs content in fermentation products in TPS1 group

表8 TPS2組酵解產(chǎn)物中SCFAs含量變化Table 8 Changes of SCFAs content in fermentation products in TPS2 group

表11 TPS1組酵解不同時間酵解液中三種腸道菌菌落總數(shù)變化Table 11 Changes in the total number of three intestinal bacteria colonies in the yeast solution at different time of TPS1 group

表12 TPS2組酵解不同時間酵解液中三種腸道菌菌落總數(shù)變化Table 12 Changes in the total number of three intestinal bacteria colonies in the yeast solution at different time of TPS2 group

3 結(jié)論

本文通過DEAE-52纖維素柱層析純化金花茶多糖得到多糖級分TPS1、TPS2和TPS3。TPS1由兩種多糖混合的雜多糖，分子量分別為15.57×104、1.04×104Da，主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成；TPS2、TPS3均為均一多糖，分子量分別為42.29×104、66.68×104Da，主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖組成。通過體外消化模型發(fā)現(xiàn)，TPS1、TPS2和TPS3在模擬口腔、模擬小腸期間，分子量未有明顯改變；在模擬胃消化期間，分子量略微降低，有少量還原糖產(chǎn)生；整個消化過程未有游離單糖檢出。通過體外酵解方法，發(fā)現(xiàn)TPS1、TPS2和TPS3在酵解期間（0～48 h），酵解液的pH、總糖含量均持續(xù)降低；還原糖含量在0～18 h期間升高，在18～48 h期間降低。酵解期間結(jié)束后，TPS1、TPS2和TPS3酵解液中乙酸濃度是空白對照組的4.1、5.5、6.7倍，丙酸濃度是空白對照組的3.7、4.7、5.4倍，丁酸濃度是空白對照組的2.3、3.2、4.2倍；TPS1、TPS2和TPS3組的乳酸菌數(shù)量分別增加了550、1513、2884倍；雙歧桿菌的數(shù)量分別增加了372、1348、1905倍；大腸桿菌數(shù)量分別減少為原來的72%、54%、32%。綜上所述，金花茶多糖在體外消化模型中不被消化，并能夠被腸道微生物分解利用而產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對乳酸菌、雙歧桿菌的增殖有積極作用，對大腸桿菌的生長具有抑制作用，且TPS3相較TPS2、TPS1，具有更好的益生作用。