高效液相色譜法測(cè)定防曬化妝品中22種化學(xué)防曬劑的含量

卓 婧,簡(jiǎn)育瑩*,盧端萍,唐 雯

(1.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院,福州 350001;2.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院,福州 350015)

隨著防曬概念不斷普及,防曬化妝品得到人們的廣泛使用。防曬劑是防曬類化妝品中的主要功效成分,可分為物理防曬劑和化學(xué)防曬劑,大部分防曬化妝品會(huì)同時(shí)添加物理防曬劑和化學(xué)防曬劑。物理防曬劑主要是氧化鋅、二氧化鈦等,安全性相對(duì)較高。化學(xué)防曬劑有苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)、3-亞芐基樟腦、二苯酮-3、奧克立林等。防曬產(chǎn)品不是一次用量越多越好,過量使用、長(zhǎng)期低劑量使用化學(xué)防曬劑存在著不同程度致癌、致畸風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。因此,建立準(zhǔn)確可靠的化學(xué)防曬劑含量測(cè)定方法是防曬化妝品質(zhì)量安全監(jiān)管的必備技術(shù)支撐。

目前,常用的化學(xué)防曬劑的測(cè)定方法有高效液相色譜法(HPLC)[4-8]、氣相色譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]等,其中HPLC為主要測(cè)定方法,適用性廣、靈敏度高、重現(xiàn)性好,其提取溶劑和流動(dòng)相主要采用甲醇(或乙腈)-四氫呋喃-高氯酸溶液。2019年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒布的第40號(hào)公告[13]也明確規(guī)定了22種化學(xué)防曬劑的檢驗(yàn)方法,并收載入《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中,該方法的提取溶劑和流動(dòng)相中使用了一定比例的四氫呋喃和高氯酸。四氫呋喃、高氯酸毒性大,對(duì)設(shè)備材料具有一定腐蝕性[14],對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境危害較大。鑒于以上方法的不足,本工作采用低毒的異丙醇代替四氫呋喃,低腐蝕性的磷酸代替高氯酸,建立了一種適用性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好,對(duì)人員、儀器、環(huán)境更為友好的HPLC 測(cè)定22種化學(xué)防曬劑含量的方法,并應(yīng)用該方法對(duì)市場(chǎng)上防曬化妝品中的化學(xué)防曬劑進(jìn)行測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器;Milli-Q 型超純水器;ELmasonic S150型超聲波清洗器,XPR56型百萬(wàn)分之一分析天平。

混合溶劑Ⅰ:體積比為5∶9的含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸的甲醇-異丙醇的混合液。

混合溶劑Ⅱ:體積比為5∶9∶2 的甲醇-異丙醇-0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)的混合液。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅰ:根據(jù)1～20號(hào)化學(xué)防曬劑(見表1)色譜響應(yīng)情況,稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量,用混合溶劑Ⅰ溶解后定容至一組20 mL 棕色容量瓶中[其中苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)用少量10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉溶液溶解后,再用混合溶劑Ⅰ定容;甲酚曲唑三硅氧烷、乙基己基三嗪酮、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚和雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪的脂溶性較高,直接用四氫呋喃溶解并定容],配制成單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅰ,其質(zhì)量濃度見表1。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅰ:移取上述單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅰ各1 mL 于同一25 mL 棕色容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅰ,其質(zhì)量濃度見表1。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅱ:稱取對(duì)苯二亞甲基二樟腦磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉適量,用混合溶劑Ⅱ溶解并定容于一組20 mL棕色容量瓶中,配制成單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅱ,其質(zhì)量濃度見表1。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅱ:移取上述單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅱ各2 mL 于同一25 mL 棕色容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅱ,其質(zhì)量濃度見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)信息以及單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制Tab.1 Related information of standards,and preparation of single standard reserve solution and mixed standard reserve solution

甲醇、異丙醇、四氫呋喃為色譜純,其余試劑為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。各標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)信息見表1。20批防曬產(chǎn)品來(lái)自監(jiān)督抽檢樣品。

1.2 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);檢測(cè)波長(zhǎng)311,340 nm;柱溫35℃;進(jìn)樣量10μL。

第Ⅰ組流動(dòng)相A 為體積比4∶1的甲醇-異丙醇混合液,B為0.1%磷酸溶液;流量1.2 mL·min－1。梯度洗脫程序:0～7.0 min時(shí),A 由20%升至60%;7.0～12.0min時(shí),A由60%升至80%,保持8.0min;20.0～30.0 min時(shí),A 由80%升至99%,保持4.0 min;34.0～34.1 min,A 由99%跳 轉(zhuǎn) 至100%,保持15.9 min;50.0～50.1 min,A 由100%跳轉(zhuǎn)至20%,保持7.9 min。

第Ⅱ組流動(dòng)相A 為甲醇,B 為0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0);流量1.0 mL·min－1;梯度洗脫程序:0～9.0 min時(shí),A 由5%升至100%,保持6.0 min;15.0～20.0 min時(shí),A 由100%降至5%,保持3.0 min。

1.3 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取化妝品樣品0.25 g,置于25 mL 納氏比色管中,加入適量的混合溶劑(第Ⅰ組防曬劑使用混合溶劑Ⅰ,第Ⅱ組防曬劑使用混合溶劑Ⅱ,下同),渦旋60 s(若為蠟基質(zhì)化妝品,則先加入1 mL 四氫呋喃,渦旋30 s),再加入混合溶劑至近刻度,超聲30 min,取出,待冷卻后定容。

精密移取上述溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,混勻,經(jīng)0.45μm 濾膜過濾作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照試驗(yàn)方法對(duì)化學(xué)防曬劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行測(cè)定,色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution

2.2 提取溶劑和第二步稀釋溶劑的選擇

2.2.1 第Ⅰ組化學(xué)防曬劑

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)方法中防曬劑樣品的提取溶劑為體積比250∶450∶300∶0.25的甲醇-四氫呋喃-水-高氯酸混合液,根據(jù)溶劑極性相似的原理,試驗(yàn)中使用低毒性、低腐蝕性的異丙醇替代四氫呋喃,考察了體積比為3∶1、9∶5、5∶9的含0.1%磷酸的甲醇-異丙醇混合液和體積比為9∶5∶6、5∶9∶6的含0.1%磷酸的甲醇-異丙醇-水混合液對(duì)第Ⅰ組20種化學(xué)防曬劑提取效果的影響。結(jié)果顯示,提取溶劑為體積比5∶9 的含0.1%磷酸的甲醇-異丙醇的混合液即混合溶劑Ⅰ時(shí)提取效果較穩(wěn)定、回收率較高,測(cè)得含量與規(guī)范方法測(cè)得的結(jié)果基本一致。

試驗(yàn)進(jìn)一步比較了在甲醇-異丙醇的混合液中分別加入體積分?jǐn)?shù)均為0.1%的磷酸、甲酸、高氯酸等不同種類的酸溶液時(shí)對(duì)第Ⅰ組20種化學(xué)防曬劑提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同種類的酸對(duì)第Ⅰ組20種化學(xué)防曬劑的提取效果無(wú)明顯差異,因此試驗(yàn)選用低刺激性的磷酸。

蠟基質(zhì)化妝品油水分配系數(shù)較大,脂溶性高,在進(jìn)行樣品提取時(shí),需先加入1 mL 四氫呋喃渦旋30 s助溶后,再加入混合溶劑渦旋、超聲提取,便于蠟基質(zhì)化妝品中化學(xué)防曬劑的充分提取。第二步稀釋溶劑考察時(shí),分別以混合溶劑Ⅰ、甲醇為稀釋溶劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),混合溶劑Ⅰ做第二步稀釋溶劑時(shí),苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)色譜峰峰形受溶劑效應(yīng)影響出現(xiàn)裂峰,而選擇甲醇作為第二步稀釋溶劑時(shí),苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)色譜峰峰形得以改善,無(wú)裂峰,對(duì)同組其余化學(xué)防曬劑響應(yīng)也無(wú)影響。綜上考慮,試驗(yàn)采用混合溶劑Ⅰ、甲醇分別作為第Ⅰ組20種化學(xué)防曬劑的提取溶劑和第二步稀釋溶劑。

2.2.2 第Ⅱ組化學(xué)防曬劑

參考第Ⅰ組提取溶劑,結(jié)合對(duì)苯二亞甲基二樟腦磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉防曬劑極性較大的特點(diǎn),試驗(yàn)分別采用體積比為5∶9∶2、5∶9∶4、5∶9∶6、5∶9∶8、5∶9∶10的甲醇-異丙醇-0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)的混合液對(duì)樣品進(jìn)行第Ⅱ組化學(xué)防曬劑的加標(biāo)提取。結(jié)果顯示,加入不同比例的0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)對(duì)對(duì)苯二亞甲基二樟腦磺酸的提取影響不大,回收率均大于90.0%;隨著0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)比例增加,苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉的回收率有所降 低,分 別 為96.7%,85.9%,85.2%,88.0%,80.9%。因此,試驗(yàn)選擇體積比為5∶9∶2的甲醇-異丙醇-0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)的混合液即混合溶劑Ⅱ?yàn)樘崛∪軇?/p>

同第Ⅰ組提取步驟,在蠟基質(zhì)化妝品樣品提取時(shí),需先加入1 mL四氫呋喃渦旋30 s助溶后,再加入混合溶劑Ⅱ渦旋、超聲提取;甲醇作為第二步稀釋溶劑時(shí),對(duì)苯二亞甲基二樟腦磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉提取效果、色譜響應(yīng)均較好。綜上考慮,試驗(yàn)中分別采用混合溶劑Ⅱ、甲醇作為第Ⅱ組化學(xué)防曬劑的提取溶劑和第二步稀釋溶劑。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱

試驗(yàn)考察了Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SYMMETRY C18、Shim-pack VP-ODS等3款色譜柱對(duì)22種化學(xué)防曬劑分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),第Ⅰ組化學(xué)防曬劑在Waters SYMMETRY C18與Shim-pack VP-ODS色譜柱上的分離效果不佳,其中樟腦苯扎銨甲基硫酸鹽與二苯酮-4、4-甲基芐亞基樟腦與二乙氨羥苯甲?；郊姿峒乎o(wú)法實(shí)現(xiàn)分離,易同時(shí)出峰;使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱時(shí),第Ⅰ組20種化學(xué)防曬劑色譜峰的峰形好,出峰時(shí)間分布合理,且基線平穩(wěn),不影響成分定性定量,第Ⅱ組化學(xué)防曬劑同樣具有良好的分離效果,響應(yīng)值高。綜合考慮,試驗(yàn)選擇Agilent ZORBAX SB-C18作為色譜柱。

2.3.2 第Ⅰ組防曬劑的流動(dòng)相

在HPLC分析測(cè)定防曬劑成分時(shí),多使用甲醇(或乙腈)-四氫呋喃-高氯酸-水混合液作為流動(dòng)相體系,該流動(dòng)相體系易對(duì)設(shè)備材料造成腐蝕,影響使用壽命。試驗(yàn)采用異丙醇、磷酸替代四氫呋喃、高氯酸,考察了以甲醇-異丙醇(體積比3∶1、4∶1、5∶1)與0.1%磷酸溶液的混合液為流動(dòng)相時(shí)對(duì)第Ⅰ組20種化學(xué)防曬劑分離效果的影響。結(jié)果顯示:甲醇-異丙醇(體積比3∶1)與0.1%磷酸溶液的混合液進(jìn)行梯度洗脫時(shí),二甲基PABA 乙基己酯與丁基甲氧基二苯甲?；淄椤⒓追忧蛉柩跬榕c乙基己基三嗪酮不易分開;甲醇-異丙醇溶液(體積比5∶1)-0.1%磷酸溶液的混合液進(jìn)行梯度洗脫時(shí),雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪出峰時(shí)間較晚,峰形不好;甲醇-異丙醇溶液(體積比4∶1)-0.1%磷酸溶液的混合液作為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí),第Ⅰ組20種化學(xué)防曬劑在58 min內(nèi)獲得良好分離。

另考察了0.1%磷酸溶液與0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液對(duì)第Ⅰ組20種化學(xué)防曬劑分離效果的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種酸均可實(shí)現(xiàn)良好分離效果。試驗(yàn)最終選擇體積比4∶1的甲醇-異丙醇溶液與0.1%磷酸溶液的混合液作為第Ⅰ組流動(dòng)相。

2.3.3 分組優(yōu)化

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015 年版)方法中對(duì)苯二亞甲基二樟腦磺酸在第Ⅰ組進(jìn)行分離測(cè)定時(shí),在其出峰位置附近基線易出現(xiàn)大幅度波動(dòng),影響該成分定量的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)將對(duì)苯二亞甲基二樟腦磺酸放在第Ⅱ組中與苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉同時(shí)分析,色譜峰附近基線平穩(wěn),利于準(zhǔn)確定量。

2.3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)

試驗(yàn)采用雙波長(zhǎng)檢測(cè),在對(duì)22種化學(xué)防曬劑進(jìn)行190～400 nm 波段紫外光譜掃描分析時(shí),發(fā)現(xiàn)大部分化學(xué)防曬劑在311 nm 附近有最大紫外吸收,而對(duì)苯二亞甲基二樟腦磺酸在340 nm 附近有最大紫外吸收,其響應(yīng)值是311 nm 處的2倍多。為了提高檢測(cè)靈敏度,試驗(yàn)選擇對(duì)苯二亞甲基二樟腦磺酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm,其余21種化學(xué)防曬劑的檢測(cè)波長(zhǎng)為311 nm,見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅰ、Ⅱ用甲醇稀釋,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。以22種化學(xué)防曬劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:22種防曬劑的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)的色譜峰面積呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)不小于0.9995,其線性參數(shù)見表2。

以陰性防曬類樣品為基質(zhì),分別加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅰ、Ⅱ,按試驗(yàn)方法制備供試品溶液,以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),以10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見表2。22種化學(xué)防曬劑的檢出限和測(cè)定下限滿足測(cè)定要求。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

選擇乳霜基和蠟基質(zhì)2種不同基質(zhì)陰性樣品,分別按試驗(yàn)方法進(jìn)行加標(biāo)(見表3,各化學(xué)防曬劑低濃度水平的加標(biāo)量),每個(gè)基質(zhì)配制6份,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,各防曬劑測(cè)定值的RSD 均小于3.5%,說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ和Ⅱ,分別放置0,4,8,12,18,24 h后進(jìn)樣,記錄各化學(xué)防曬劑的峰面積。結(jié)果顯示,該體系中各化學(xué)防曬劑峰面積的RSD 為0.89%～2.3%,表明混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

選擇乳霜基和蠟基質(zhì)2種不同基質(zhì)陰性樣品,添加低、中、高等3個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法制備供試品溶液并測(cè)定,計(jì)算回收率及測(cè)定值的RSD,結(jié)果見表3。

由表3 可知,2 種基質(zhì)中各組分的回收率為86.9%～113%,測(cè)定值的RSD 為0.10%～5.6%,表明該法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝9)

表3 (續(xù))

2.8 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)20批防曬化妝品進(jìn)行測(cè)定,并將測(cè)得的防曬劑含量與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中方法測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果見表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果比較Tab.4 Comparison of determination results of samples %

表4 (續(xù))%

結(jié)果顯示,20批樣品共檢出14種化學(xué)防曬劑,兩種方法測(cè)定結(jié)果基本一致。

化學(xué)防曬劑的分析檢測(cè)方法中提取溶劑和流動(dòng)相多采用含有一定比例的四氫呋喃和高氯酸體系,毒性大,易揮發(fā),腐蝕性強(qiáng),對(duì)設(shè)備和配件要求較高,長(zhǎng)期使用易縮短設(shè)備使用壽命。本工作建立了一種低毒性、低腐蝕性,對(duì)儀器、人員、環(huán)境友好的HPLC測(cè)定22種化學(xué)防曬劑含量的分析方法,用異丙醇、磷酸代替了四氫呋喃和高氯酸,優(yōu)化樣品提取溶劑和流動(dòng)相,采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)分析,靈敏度高,重現(xiàn)性好,可操作性強(qiáng),可為化學(xué)防曬劑的檢測(cè)分析提供參考。