基于光譜學技術結合分子模擬研究芹菜素與大豆分離蛋白的相互作用

鄢雨中，陳 蕾，張國文

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

大豆(Soybean)是一種具有很高食用價值和經(jīng)濟價值的農(nóng)作物，在食品中非常常見。大豆也是蛋白質(zhì)含量很高的農(nóng)作物，含有約為40%的蛋白質(zhì)，其中的大豆分離蛋白(Soybean protein isolate,SPI)不僅包含了人體所需要的8種氨基酸，而且其含量也能滿足人體所需要。大豆分離蛋白具有營養(yǎng)豐富、綠色健康等優(yōu)點，可以有效補充人體所需的蛋白，且消化率可高達93%～97%。在健康方面可幫助人體制造對抗病毒的抗體，補充免疫細胞，增強免疫力，還可以降低膽固醇、血糖，促進鈣元素吸收[1]。

芹菜素(Apigenin，API)是一種黃酮類化合物，常被稱為芹黃素和洋芹素[2]，在西芹、水芹、橙子和洋甘菊等綠色蔬菜、新鮮水果及菊科植物中含量豐富，具有抗腫瘤、抗炎、降壓和舒張血管等藥理活性[3]，是一種治療效果優(yōu)良、安全低毒的植物活性成分，已被廣泛應用于食品和醫(yī)藥領域中。

近年來黃酮類化合物與蛋白質(zhì)相互作用的研究受到了普遍關注。江名等[4]采用熒光光譜法結合分子模擬技術研究了API與人血清蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)芹菜素能猝滅人血清蛋白內(nèi)源性熒光，API的結合位點位于ⅡA亞域處，分子模擬顯示二者主要通過疏水作用結合。劉勤勤[5]利用熒光光譜茶多酚與大豆分離蛋白之間的相互作用，結果表明，茶多酚對大豆分離蛋白有較強的熒光猝滅作用且為靜態(tài)猝滅，二者反應的作用力主要是范德華力和氫鍵作用，同步熒光光譜顯示茶多酚與大豆分離蛋白中色氨酸殘基發(fā)生相互作用，使其周圍的疏水作用減少。本文研究黃酮類化合物API與SPI的結合性質(zhì)、結合模式以及對SPI結構的影響，旨在為API-SPI包載體系的構建以及SPI功能性質(zhì)的改善提供理論基礎。

圖1 芹菜素的分子結構

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；F-7000型熒光光度計(日本日立公司)；MOS-450圓二色譜儀(法國Bio-Logic公司)；Varioskan LUX型酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；pHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)；5430R型高速臺式離心機(德國艾本德股份公司)。

1.2 實驗試劑

大豆分離蛋白(上海源葉生物科技公司，純度≥99.5%)；芹菜素(陜西慧科植物開發(fā)有限公司，純度98%)；8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS)；pH 7.07的PBS緩沖溶液(以Na2HPO4·12H2O與NaH2PO4·2H2O配制而成)；十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O，西隴化工股份有限公司，純度≥99.0%)；磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O，上海精析化工科技有限公司純度，≥99.0%)；其他試劑的純度均為分析純，實驗用水為超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 熒光猝滅光譜的測定

移取3.0 mL質(zhì)量濃度為3 mg·mL-1的SPI溶液于比色皿中，在280 nm的激發(fā)波長下掃描其熒光光譜后，再向裝有SPI溶液的比色皿中依次加入API(3.7×10-3mol·L-1，3 μL/次，共10次)，每次加入API后將溶液混合均勻，去除氣泡后靜置2 min，再掃描其290～500 nm的熒光光譜，共測得11條光譜曲線。按照上述操作，分別測定25，31和37 ℃ 3個溫度下的熒光光譜，并記錄數(shù)據(jù)，所有的熒光數(shù)據(jù)都需經(jīng)過以下公式進行校正以扣除“內(nèi)濾光效應”所帶來的實驗誤差[6]：

Fc=Fme(A1+A2)/2

(1)

式中Fc為校正后的熒光強度值；Fm為實驗所測得的熒光強度值；A1為API在激發(fā)波長下的紫外吸光度值；A2為API在發(fā)射波長下的紫外吸光度值。

1.3.2 同步熒光光譜的測定

移取3.0 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1的SPI溶液于熒光池中，逐次滴加3 μL的API溶液10次，在25℃下，設置激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為2.5 nm，掃描290～420 nm波長范圍內(nèi)發(fā)射和激發(fā)波長間隔Δλ分別為15和60 nm的同步熒光光譜，各得到11條光譜曲線。

1.3.3 三維熒光光譜的測定

移取3.0 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1的SPI溶液于熒光池中，在200～600 nm的激發(fā)和發(fā)射波長下，記錄游離的SPI溶液和加入了15 μL 3.7×10-3mol·L-1API的SPI-API復合物溶液的三維熒光光譜。

1.3.4 紫外-可見吸收光譜的測定

移取3.0 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1的SPI溶液于比色皿中，紫外光譜掃描之后，依次加入3.7×10-3mol·L-1的API(5 μL/次)，混合均勻并靜置2 min，然后測定220～320 nm范圍的吸收光譜，并掃描對應游離濃度的API的吸收光譜。

1.3.5 蛋白質(zhì)表面疏水性測定

采用ANS熒光探針法測定蛋白質(zhì)疏水性。先將SPI溶液溶于PBS溶液中，取SPI溶液2 mL，加入20 μL 8.0 mmol·mL-1ANS，混合均勻后，靜置3 min。設置激發(fā)波長λex=390 nm，發(fā)射波長λem=470 nm，二者狹縫均設為5 nm，測定熒光強度后，依次加入3.7×10-3mol·L-1的API(5 μL/次，共4次)，混合均勻并靜置2 min，測定熒光強度，每組測定3次，取平均值。重復以上操作，分別測量在SPI溶液質(zhì)量濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg·mL-1時的熒光強度，將計算后所得的平均熒光強度作為因變量，SPI溶液的質(zhì)量濃度作為自變量，繪制線性回歸曲線，所得的相應曲線斜率即為蛋白質(zhì)表面疏水指數(shù)S0，再以曲線的斜率對API濃度作圖，即可獲得蛋白質(zhì)表面疏水性的變化。

1.3.6 蛋白質(zhì)游離巰基含量測定

采用Dong等[7-8]的方法測定蛋白質(zhì)游離巰基含量。配制尿素-Tris-Gly緩沖液(0.086 mol·L-1Tris，0.09 mol·L-1Gly，4 mmol·L-1EDTA，pH 8.0，8 mol·L-1尿素)，然后配制Ellman試劑(4 mg DTNB溶解于1 mL的Tris-Gly緩沖液)，先取11個小管，分別加入1 mL 3.0 mg·mL-1的SPI溶液，按照梯度分別加入2 μL 3.7×10-3mol·L-1API，混合均勻。再取11個小管分別加入1 mL尿素-Tris-Gly緩沖液，10 μL Ellman試劑，250 μL不同濃度的API-SPI混合液，用PBS緩沖溶液作空白，在412 nm處測定吸光度，巰基含量的計算公式如下。

巰基含量/(μmol·g-1)=73.53×A412/ρ

(2)

其中A412為412 nm處吸光值；73.53=106/(1.36×104)，1.36×104為摩爾消光系數(shù)(L·cm·mol-1)；ρ為蛋白質(zhì)量濃度(mg·mL-1)。

1.3.7 圓二色光譜的測定

分別移取2 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1的SPI溶液，0，6，48 μL濃度為3.7×10-3mol·L-1的API溶液，配制[API]:[SPI]摩爾比率為0:1，2:1，16:1的樣品，在190～250 nm范圍內(nèi)掃描樣品的圓二色光譜，每組掃描3次，通過在線Dichroweb網(wǎng)站求出加入不同濃度的API后SPI的二級結構含量(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量)，分析API對SPI二級結構的影響。

1.3.8 分子模擬

采用Discovery studio軟件對SPI-API復合物進行分子建模。SPI中含有的蛋白類型主要為7s型與11s型。兩種類型蛋白的晶體結構從Protein Data Bank網(wǎng)站下載(1h9z)，去除水分子再進行加氫及加電荷處理。從PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得API的3D結構。利用分子模擬中的CDOCKER程序分別進行API與兩種蛋白的對接模擬，獲得API與SPI結合的最佳模式以及周圍氨基酸殘基的相互作用情況。

2 實驗結果

2.1 熒光猝滅機理

圖2為向SPI中不斷滴加API后SPI的熒光光譜。隨著滴加的API濃度的不斷升高，SPI在347 nm處的熒光強度逐漸降低，表明API與SPI相互作用導致了SPI的熒光猝滅。

λ/nm

溫度是影響熒光猝滅的一個關鍵因素，可利用不同溫度下的熒光數(shù)據(jù)通過計算得出猝滅常數(shù)來判斷猝滅類型[9]。熒光猝滅可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[10]，動態(tài)猝滅是指激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑發(fā)生能量轉(zhuǎn)移或物理碰撞使其熒光猝滅；靜態(tài)猝滅是指熒光分子與猝滅劑相互結合形成一種復合物，該復合物使熒光分子熒光強度降低，從而產(chǎn)生了熒光猝滅現(xiàn)象[11]。一般而言，當猝滅常數(shù)值隨溫度的上升而減小時，將其判定為靜態(tài)猝滅，反之則為動態(tài)猝滅[12]。本實驗測定了25，31和37 ℃ 3個溫度下API對SPI的熒光猝滅數(shù)據(jù)，運用Stern-Volmer方程進行計算[13]。

F0/F=1+KSVc=1+Kqτ[API]

(3)

式中:F0和F分別代表API加入前后SPI的熒光強度；Kq為猝滅速率常數(shù)；Ksv為猝滅常數(shù)；τ0為不含有猝滅物質(zhì)時熒光分子的平均壽命，為10-8s[14]。

通過F0/F對[API]作線性回歸方程可得出Ksv值，結果如圖3與表1所示，Ksv值隨溫度的上升稍有增大，但是Kq的值遠高于最大擴散碰撞常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)，超過了擴散控制的極限，所以推斷API對SPI的熒光猝滅是一個靜態(tài)猝滅過程[15]。

AP/(10-6 mol·L-1)圖3 在25、31和37 ℃三個溫度條件下的Stern-Volmer曲線

表1 不同溫度下API與SPI作用的結合參數(shù)

2.2 結合常數(shù)與結合位點數(shù)

如果小分子與蛋白質(zhì)二者之間的猝滅方式是靜態(tài)的過程，可運用公式(4)對數(shù)據(jù)進一步計算得到API與SPI相互作用的結合常數(shù)Ka和結合位點數(shù)n[16]：

lg(F0-F)/F=lgKa+nlg[Q]

(4)

式中：F和F0分別表示加入了和還未加入API時SPI的熒光強度；Ka為表觀結合常數(shù)，n為結合位點數(shù)，[Q]為API的濃度。

以lg[Q]為橫坐標，lg(F0-F)/F為縱坐標作圖，經(jīng)過擬合后得到回歸曲線(圖4)，三條線的斜率即為結合位點數(shù)n，截距為lgKa，通過計算可得出表觀結合常數(shù)Ka。如表1所示，n值近似為1，說明API于SPI上僅有一個結合位點；隨著溫度的上升，結合常數(shù)Ka呈現(xiàn)下降趨勢，表明溫度升高使SPI-API結合體系的穩(wěn)定性下降。

2.3 熱力學參數(shù)與作用力

小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用力主要有疏水作用、范德華力、氫鍵和靜電作用[17]。如果焓變?yōu)檎?、熵變?yōu)檎担瑒t兩者之間主要是疏水作用；如果焓變?yōu)樨撝怠㈧刈優(yōu)樨撝?，則兩者之間主要是范德華力與氫鍵作用；如果焓變?yōu)樨撝?，熵變?yōu)檎担瑒t兩者之間主要是靜電作用[18]，可采用反應的焓變ΔH°和熵變ΔS°判斷API與SPI之間的相互作用力類型。熱力學參數(shù)可通過以下公式計算得出[19]：

圖4 在25，31和37 ℃三個溫度條件下API猝滅SPI的雙對數(shù)圖

(5)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(6)

公式(5)中R表示氣體常數(shù)(8.31 J·mol-1·K-1)，T為熱力學溫度(298，304，310 K)，Ka為結合常數(shù)。計算得到的ΔH°、ΔS°和ΔG°值列于表1中。ΔG°<0，表明反應是自發(fā)進行的，ΔS°和ΔH°均<0，表明API與SPI的結合是一個放熱的過程，二者之間的作用力主要是氫鍵和范德華力。

2.4 同步熒光光譜

同步熒光光譜法常用來探測小分子與蛋白質(zhì)相互作用后對蛋白質(zhì)氨基酸微環(huán)境的影響，波長差為15 nm顯示的是酪氨酸殘基的熒光光譜，波長差為60 nm顯示的是色氨酸殘基的熒光光譜，由此可判斷API與SPI相互作用對兩種氨基酸殘基微環(huán)境的影響[20]，最大熒光發(fā)射峰的紅移和藍移分別表明對應氨基酸殘基周圍微環(huán)境的極性和疏水性變化[21]。

圖5表示常溫下SPI-API的同步熒光光譜圖，從圖中可以看出，隨著API濃度的不斷增大，酪氨酸、色氨酸的熒光強度都逐漸下降，最大發(fā)射峰位置都有稍許移動，其中酪氨酸的發(fā)射峰位從292 nm藍移至290 nm，而色氨酸的發(fā)射峰位從285 nm紅移至287 nm，表明API與SPI作用改變了SPI上的酪氨酸殘基、色氨酸殘基所處的微環(huán)境，酪氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性增加，而色氨酸殘基周圍微環(huán)境極性增加[22]。

(A) Δλ=15 nm

(B) Δλ=60 nm圖5 25 ℃時SPI-API體系的同步熒光光譜圖

2.5 三維熒光光譜分析

通過三維熒光光譜實驗可以了解到更多的API對SPI構象影響的信息。如圖6所示，peak1主要表示色氨酸和酪氨酸殘基的內(nèi)源熒光特征吸收峰，peak2主要反映蛋白質(zhì)多肽鏈骨架結構的熒光特征吸收峰。通過向SPI中添加API，peak1和peak2的熒光強度顯著降低，表明API與SPI的相互作用引起了多肽鏈一定程度的伸展，一部分包埋在分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露出來，從而導致蛋白質(zhì)構象的改變[23]。

(A) SPI三維熒光光譜

(B) SPI-API復合物三維熒光光譜圖6 SPI-API體系的三維熒光光譜圖

2.6 紫外-可見吸收光譜分析

圖7為向SPI溶液中依次滴加一定量的API后掃描出的紫外-可見吸收光譜圖(已扣除相應的空白)。SPI在260 nm附近有一個強吸收峰，為蛋白質(zhì)肽鍵的特征峰，反映蛋白質(zhì)多肽鏈的變化。隨著API濃度的增加，該吸收峰的強度逐漸增大并發(fā)生紅移，表明API誘導SPI的肽鏈延伸，吸光度增加，構象發(fā)生改變[24]。

2.7 圓二色光譜分析

圓二色光譜可以用來測定API誘導的SPI的二級結構變化。在氮氣環(huán)境條件下，測量[SPI]:[API]分別為1:0、1:2、1:16時，復合物的圓二色光譜。圖8顯示，在200～205 nm之間有一個負峰，代表著SPI的α-螺旋的特征峰[25]，隨著API濃度的不斷增加，SPI的CD強度不斷產(chǎn)生微小減弱，峰的位置也有輕微的藍移，表明API的加入對SPI的周圍的疏水微環(huán)境和二級結構產(chǎn)生了影響[26]，通過網(wǎng)站Dichroweb在線軟件可求出加入不同濃度API后SPI的二級結構(α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲)的含量。如表2所示，隨著API濃度的升高，α-螺旋含量從24.66%降至18.16%，β-折疊含量從49.33%降至35.34%，β-轉(zhuǎn)角含量從14.23%升至22.80%，無規(guī)則卷曲含量從11.69%升至23.69%，α-螺旋含量的減少表明了API與SPI結合后會導致蛋白質(zhì)多肽鏈部分伸展，使其暴露在疏水性環(huán)境中[27]。

λ=15 nm

λ=15 nm

表2 不同濃度API-SPI體系的二級結構含量

2.8 API對蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)的表面疏水性是蛋白質(zhì)的重要特性參數(shù)，在維持蛋白質(zhì)的構象和生物活性方面起到重要的作用[28]，采用ANS熒光探針法測定蛋白質(zhì)的疏水性。

如圖9所示，5條曲線分別代表加入的芹菜素濃度為0，6.17，12.33，18.5，24.67×10-6mol·L-1，隨著芹菜素濃度的增加，5條曲線的斜率逐漸降低，大豆分離蛋白表面疏水性指數(shù)S0逐漸下降，表明隨著加入芹菜素濃度的增大，SPI與ANS的解離能力增強，結合能力降低，ANS會更難與SPI結合，API與SPI結合會使SPI疏水性性能下降，且溶液中API濃度越大，疏水性降低越明顯[14]。

SPI/(mg·mL-1)圖9 API對ANS-SPI體系中熒光強度的影響

2.9 API對SPI游離巰基含量的影響

巰基是蛋白質(zhì)的重要功能性基團，巰基具有抗氧化、亞硝基化、巰基-二硫鍵交換等作用。如圖11所示，隨著API含量的增加，SPI游離巰基含量明顯上升，可能是因為與API作用，使SPI的半胱氨酸殘基暴露，巰基含量增加。

API/(10-6 mol·L-1)

2.10 分子模擬

分子模擬是利用計算機以原子水平的分子模型來模擬分子的結構和作用力[29]，通過分子模擬可以直觀地展示API與SPI的相互作用的結合模式和結合位點[30]。大豆分離蛋白不是純蛋白，其中主要成分為7s型蛋白與11s型蛋白，故分別選擇7s與11s型蛋白與芹菜素進行結合分析。

如圖12所示，API分子插入了SPI-7s的疏水空腔中，并且被LEU226，GLN77，THR75，HIS76，ASN74等氨基酸包圍，同時，API分子與氨基酸殘基HIS76，ANS74形成2個氫鍵，鍵長分別為3.43?與4.59?。如圖13，API分子插入SPI-11s中，被THR353，THR328，MET329，LEU354，ASP342，LYS113，THR358，LYS330等氨基酸包圍，同時，API分子與氨基酸殘基ARG340，LYS330，THR358，THR328，SER339形成氫鍵，鍵長分別為5.77?，5.27?，4.55?，4.21?，3.333?。這可能是由于API本身含有3個羥基，易形成氫鍵，表明API與SPI的結合作用力主要是由范德華力和氫鍵，這與熱力學分析結果相吻合。

圖11 API與SPI-7s的結合模式圖

圖12 API與SPI-11s的結合模式圖

3 結論

本文采取了多種光譜學方法結合分子模擬技術對API與SPI的相互作用進行了研究，結果表明，API與SPI能夠形成復合物，其結合常數(shù)在103數(shù)量級，API的加入能使SPI的內(nèi)源熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，氫鍵和范德華力是二者結合過程中的主要驅(qū)動力。API的加入降低了SPI的表面疏水性，增加了巰基含量，使SPI上的酪氨酸殘基與色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性和疏水性發(fā)生改變，導致SPI的α-螺旋含量從24.66%降至18.16%，β-折疊含量從49.33%降至35.34%，β-轉(zhuǎn)角含量從14.23%升至22.80%，無規(guī)則卷曲含量從11.69%升至23.69%，SPI結構變得更加疏松。分子模擬顯示API分子插入到SPI的疏水空腔中，API分子與SPI-7s的氨基酸殘基HIS76，ANS74形成2個氫鍵，與SPI-11s的氨基酸殘基ARG340，LYS330，THR358，THR328和SER339形成氫鍵。