線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞模型的改良技巧及效果研究*

趙舒蒙，王 丹，車文文，王松濤，邱繼文△

(1.西安翻譯學院健康與運動學院，陜西 西安 710105；2.天津中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，天津 301617；3.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，天津 301617)

流行病學研究顯示，腦卒中居人口死亡和致殘因素的榜首，發(fā)病率有逐年增高的趨勢，在不同程度上加重了社會、家庭及個人的生活和經(jīng)濟負擔[1-2]。腦卒中分為缺血性卒中和出血性腦卒中，前者在臨床上尤為常見(約占70%)[3]，且好發(fā)于大腦中動脈(MCA)。

目前，對于缺血性腦卒中的主要實驗研究模型為大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。?ANAK?I等[4]認為大鼠因具有與人類相似的腦血管解剖結(jié)構(gòu)與功能，易獲取、價格低等特點，所以被用于缺血性腦卒中實驗的病理生理學變化、發(fā)病機制和防治措施等相關(guān)機制研究。因此，對于建立能夠模擬人類缺血性腦卒中且可信度高、穩(wěn)定性好、操作性強的動物模型必不可少。本文通過建立大鼠MCAO模型，研究改良后制作方法建立模型的成功率和存活率。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康清潔級雄性SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)30只，體重250～280 g，鼠齡2.5～3.0 月。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2方法

1.2.1自制石蠟線栓 將直徑 0.22 mm 的尼龍魚線切割成長 4.0 cm 的線栓，切面盡量平齊，避免形成銳利的邊緣和斜面。將線栓的一端和中間 2.0 cm 處用黑色記號筆進行標記。加熱熔化固體石蠟為液體，令石蠟液體逐漸冷卻直至液體表面將要凝固，此時將線栓記號筆標記的一端快速垂直浸入石蠟，然后快速提起，使線栓標記端表面凝固一薄層石蠟后在顯微鏡下觀察，篩選石蠟端光滑圓鈍、直徑約0.28 mm的線栓，去掉石蠟過短、粗糙、形狀不規(guī)則、未包裹住頭端的線栓。采用75%的乙醇對自制石蠟線栓進行消毒，將其浸泡于生理鹽水中備用。

1.2.2建立模型 本研究采用線栓法建立大鼠MCAO模型，建立模型前所有大鼠禁食不禁飲1 d。具體操作如下：在室溫條件下(25 ℃)，采用3%異氟烷混合30%氧氣和70%空氣，通過小動物麻醉機(公司：Midmark，型號：Matrx VMR)進行誘導麻醉，見圖1A。采用2%的異氟烷面罩維持麻醉，見圖1B。麻醉后，將大鼠仰臥固定在自制鼠板上，剔除頸部正中皮毛，聚維酮碘消毒，剪開約3cm長切口，暴露頸總動脈(CCA)，逐步剝離迷走神經(jīng)及其周圍小神經(jīng)血管，剝離頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，見圖1C。備線結(jié)扎CCA近心端和ECA近分叉口處，同時在ICA近分叉口處采用動脈夾夾閉，并在 CCA 分叉口處上方5mm 左右備線，打活結(jié)，用眼科剪在CCA上剪一45°斜向下切口，將線栓插入切口并將備線系緊，程度為切口處不出血為宜。松開動脈夾，緩慢、柔和地朝向 ICA 插入制備線栓，見圖1D。在此過程中，應(yīng)防止由于手法不當導致血管痙攣引起插入線栓困難，同時切勿牽拉過猛引起血管痙攣，避開翼腭動脈，若感覺遇到阻力無法插入線栓，則將線栓向外提拉，換方向繼續(xù)插入，至標記1.8 cm處且接近 CCA 近分叉處時，停止，備線，結(jié)扎CCA，見圖1E。剪斷剩余線頭，頸部傷口處加少量慶大霉素以防感染，縫合切口后聚維酮碘消毒，見圖1F。將大鼠放入25 ℃恒溫保溫箱中，直至大鼠完全清醒。清醒后的大鼠單籠飼養(yǎng)，保持籠內(nèi)干燥，并保證大鼠能夠自由攝取食物和飲用水，見圖1G。

A:誘導麻醉；B:維持麻醉；C:暴露ECA和ICA；D:插入線栓；E:插入線栓后；F:縫合切口后；G:清醒后大鼠。

1.2.3指標評價

1.2.3.1TTC染色 建立模型24 h后，隨機挑選符合神經(jīng)功能5分制評分法(4分：意識低下甚至昏睡，不能行走；3分：向病灶對側(cè)傾倒；2分：向病灶對側(cè)轉(zhuǎn)圈；1分：病灶對側(cè)前肢不能伸展；0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀)[5]成功標準的3只大鼠進行形態(tài)學檢測(TTC染色)。

1.2.3.2存活率 存活率=2、7 d內(nèi)存活大鼠/制備成功大鼠模型數(shù)量×100%。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析。存活率和成功率屬于計數(shù)資料，采用率或構(gòu)成比表示。

2 結(jié) 果

2.1成功率 本實驗30只大鼠中，符合神經(jīng)功能5分制評分法標準即成功建模的大鼠28只，成功率為93.33%，形態(tài)學檢測見圖2。

白色區(qū)為MCA供血區(qū)。

2.2存活率 模型制備后2、7d的存活率分別為100.00%(28/28)和82.14%(23/28)。

3 討 論

3.1線栓法制備大鼠MCAO模型方法 線栓法制備的大鼠MCAO模型與人類缺血性腦卒中模型發(fā)病機制相似度高，因此線栓法在此類研究中最常見，應(yīng)用最廣泛。該模型以其不開顱、易操作、損傷小、缺血效果肯定、重復性好、可準確控制缺血及再灌注時間、大腦中動脈閉塞及再灌注效果好，以及對大鼠生理指標影響小等優(yōu)點受到眾多學者的高度認可[5-7]。

目前，評價模型制備是否成功及腦梗死測定的參考僅依據(jù)神經(jīng)癥狀評分和TTC染色，前者不能避免主觀評價，后者無法及時評價，影響實驗研究的準確性。隨著多數(shù)研究者對線栓法的不斷改進和完善，提高了模型的成功率。改善的方面包括線栓制備、切口位置、是否結(jié)扎翼腭動脈、線栓插入的方法、線栓插入深度、造模后護理等[8-9]。

3.2麻醉方法對MCAO的影響 本實驗中采用異氟烷對大鼠進行麻醉制備模型。通過閱讀文獻發(fā)現(xiàn)，動物實驗中，水合氯醛和異氟烷均是常用的麻醉劑[10-11]。但研究顯示，水合氯醛由于劑量及對呼吸道腺體的作用等，容易導致手術(shù)過程中、術(shù)后出現(xiàn)較多問題，如呼吸道阻塞、蘇醒時間延長等，會對實驗過程和結(jié)果產(chǎn)生影響[10，12]。由于制備模型時間長，麻醉劑量不足會導致大鼠手術(shù)中掙扎，影響手術(shù)；而再補加麻醉藥物時，由于麻醉藥物劑量不能確定，可能麻醉過量，造成呼吸抑制、大鼠死亡或清醒推遲影響神經(jīng)功能癥狀評分；麻醉藥物劑量過多，可能會導致大鼠術(shù)后出現(xiàn)腸梗阻、腹膜炎等多種不良反應(yīng)，造成模型成功率降低，增加實驗成本。

與水合氯醛相比，異氟烷屬于吸入性麻醉劑，麻醉濃度和深度可控性較強，而且術(shù)后大鼠清醒時間縮短，更加方便安全。因此，作為動物實驗麻醉藥物的選擇，異氟烷效果更優(yōu)，可以穩(wěn)定大鼠血氧分壓、心率等，同時對于腦缺血再灌注、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護作用[11,13]。本實驗中，大鼠模型成功率為93.33%；且大鼠模型制備后2、7 d內(nèi)，存活率分別為100.00%和82.14%，說明異氟烷作為麻醉劑對于模型制備的成功率和存活率作用較大。

3.3頸部神經(jīng)、血管分離中的注意事項 本實驗中，麻醉后分離大鼠頸部神經(jīng)、血管時，應(yīng)注意在兩側(cè)的鼓泡腺體之間進行，對于頸前肌群的充分暴露十分必要，且不會損傷腺體。首先充分暴露CCA，其次，逐步剝離迷走神經(jīng)，剝離、暴露ECA和ICA。需要注意的是，在頸部血管分離過程中，應(yīng)盡量保證剝離干凈血管外膜，避免牽拉損傷ICA和ECA分叉處的交感神經(jīng)節(jié)和迷走神經(jīng)，因為牽拉損傷可能造成大鼠死亡或呼吸抑制，從而降低模型成功率和存活率。

3.4線拴插入過程中的注意事項 線栓進入ECA后，多數(shù)情況下能順利插入至MCA，但有時插入時則會遇到明顯阻力，難以進入，這時一定不能繼續(xù)盲目反復插入，正確的做法是抽出較多線栓，調(diào)整線栓角度，重新進入。如果仍不能進入應(yīng)及時更換新的線栓。插入線栓時很難進入是因為血管穿入顱骨時有一個狹窄或角度，這時若盲目插入，極易損傷血管。線栓不能在血管內(nèi)反復用力提插，否則會引起線栓前端變形，導致插入時損傷血管或血管痙攣，造成顱內(nèi)出血或線栓插入困難情況的發(fā)生，影響模型質(zhì)量，延長造模時間。如出現(xiàn)此類情況，應(yīng)將線栓稍向外退出，調(diào)整插入方向，再進行插入，若仍然出現(xiàn)插入困難，應(yīng)及時更換線栓。

線栓插入深度也應(yīng)注意。線栓插入淺會造成制備模型失敗，線栓插入深易引起蛛網(wǎng)膜下腔出血；若線栓插入時大鼠出現(xiàn)顫動，說明線栓誤插入至翼腭動脈。線栓插入切勿過深，過深易損傷血管造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，神經(jīng)功能癥狀過重且造成大鼠生存周期短。本實驗前期大量制備模型時發(fā)現(xiàn)，線栓插入深度18 cm時，大鼠術(shù)后神經(jīng)功能評分穩(wěn)定且成模率高，張成英等[14]報道，線栓插入深度為17～19 cm。因此，本實驗線栓插入深度為18 cm。

3.5術(shù)后感染的預防 術(shù)前對手術(shù)器械、大鼠手術(shù)切口都要進行嚴格的消毒，術(shù)后縫合前在傷口周圍噴少量慶大霉素以防感染，縫合后傷口部位用聚維酮碘消毒，可降低模型死亡率，有助實驗順利進行。

3.6術(shù)后護理和營養(yǎng)支持 在室溫條件下(25 ℃)進行手術(shù)，對大鼠進行白熾燈照射以維持大鼠正常體溫。術(shù)后將大鼠放入25 ℃恒溫透明保溫箱中，直至大鼠完全清醒。前期實驗發(fā)現(xiàn)，術(shù)后部分大鼠出現(xiàn)進食、便溏、消瘦等癥狀[8-11]。因此本實驗術(shù)后采用1%的蔗糖水3～5 mL添加至飲用水中，給予大鼠營養(yǎng)支持。

綜上所述，在動物實驗研究中，應(yīng)根據(jù)研究方向和觀察指標選擇不同的造模方法，這是進行動物實驗的首要條件。同時，不同大鼠MCAO模型制備方法各有利弊，適用范圍不盡相同。作者認為，成功的大鼠MCAO模型應(yīng)至少滿足以下條件：(1)成功率、存活率高；(2)梗死灶位置固定，梗死范圍和程度可控；(3)與人類缺血性腦卒中生理病理發(fā)生、發(fā)展變化過程一致，以此有利于對各種繼發(fā)性損害及誘發(fā)因素的研究；(4)重復性高，穩(wěn)定性和可操作性強，成本低。然而，目前尚缺乏高質(zhì)量的MCAO模型，仍存在許多不可控因素，因此，科研人員仍需要在實踐中不斷探索，最大限度地復制與人類局灶性腦缺血發(fā)病過程近似的動物模型及控制相關(guān)影響因素，建立更加科學合理的模型制備方法，規(guī)范化MCAO模型的制備，這將更有利于深入研究缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展機制。