血漿抗糖抗體檢測在IgA腎病中的作用及其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

楊鋼 劉靜

作者單位：1.武漢市紅十字會醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北，武漢430000

2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北，武漢430000

IgA腎病是最為常見的一種原發(fā)性腎小球疾病。IgA腎病四重打擊學(xué)說指出IgA腎病主要病理特征為鉸鏈區(qū)O 糖的半乳糖缺陷型IgA1 在腎小球系膜中與特定受體相互作用，通過激活補體或成為自身免疫應(yīng)答抗IgA 的靶點而沉積在腎小球膜中，誘導(dǎo)活化腎小球系膜基質(zhì)使基質(zhì)合成增加，損傷細(xì)胞；同時半乳糖缺陷型IgA 通過與RR Fcα/γ 相互作用，激活循環(huán)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，增強(qiáng)其對腎小球膜細(xì)胞的趨化作用，引起炎癥浸潤，持續(xù)損傷間質(zhì)，最終導(dǎo)致腎臟損傷和疾病進(jìn)展［1-2］。然而該學(xué)說仍缺乏廣泛的證據(jù)支持，尤其是抗糖抗體在IgA腎病中的作用有待進(jìn)一步探究。因此，本研究通過抗糖抗體測定探討抗糖抗體檢測在IgA腎病中的作用及其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年3月至2020年4月本院收治的IgA腎病患者80 例，為IgA 組，其中男46 例，女34 例，平均年齡（48.13±7.14），BMI 平均指數(shù)（26.12±3.10）；另選取同期80 例健康人群為對照組，其中男42 例，女38 例，平均年齡（46.18±6.73），BMI 平均指數(shù)（25.84±3.27）。兩組性別、年齡、BMI 指數(shù)、SBP、DBP 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有參與者均已知情并簽署同意書。本實驗經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合2016年版《原發(fā)性IgA腎病診治循證指南》［3］中IgA腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡在18～75 歲之間；③患者依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1月內(nèi)服用腎毒性藥物者；②合并心、腦等嚴(yán)重的器質(zhì)性病變者；③其他病因所致的腎臟疾病者；④合并其他自身免疫性疾病或嚴(yán)重感染者；⑤臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 半乳糖缺陷IgA1（Gd-IgA1）測定

采用山羊抗人IgA 多克隆抗體F（ab）′2（2.5 mg/L）包被96 孔酶標(biāo)板，孵育過夜，小牛血清蛋白封閉未結(jié)合位點。稀釋IgAN 患者血漿，設(shè)復(fù)孔及空白對照孔。唾液酸酶37℃酶切后，加HPA 與GalNAc 結(jié)合，37℃孵育。加HRP 標(biāo)記生物親和素，37℃孵育。過氧化物酶底物顯色，TMB A 液與B 液以1∶1 混勻，室溫下避光顯色，1 mol/L H2SO4 終止顯色。酶標(biāo)儀450/570 nm 雙波長讀數(shù)。分別以Gd-IgA1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度及相應(yīng)A 值以Logistic 四參數(shù)擬合各自標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終求得各樣品濃度。將1 μg IgA1 混合物的缺糖IgA1 定義為1 U，最終Gd-IgA1 濃度單位以U/mL 表示。

1.2.2 抗糖抗體測定

抗原制備：分離并純化患者血漿IgA1，通過細(xì)菌培養(yǎng)獲得IgA1 特異性蛋白酶HF48；從鉸鏈區(qū)237 和238 氨基酸之間切開IgA1 分子，最大程度保留該區(qū)Fab 段抗原的完整性，純化保留Fab-HR抗原。用HAA-Western 印跡法驗證純化的Fab-HR自身抗原存在半乳糖的缺失；IgG 型抗糖抗體測定：采用ELISA 法測定，將Fab-HR 包被酶標(biāo)板，孵育過夜；加入1∶20 稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品血漿，ALP 標(biāo)記的山羊抗人IgG 抗體檢測IgG 型抗糖抗體。酶標(biāo)儀450 nm 讀數(shù)，ALP 底物顯色液室溫避光顯色，計算IgG 型抗糖抗體濃度。IgA1 型抗糖抗體測定：采用ELISA 法測定，將Fab-HR 包被酶標(biāo)板，孵育過夜；加入1∶20 稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品血漿；HRP 標(biāo)記的小鼠抗人IgA1 重鏈抗體檢測IgA1 型抗糖抗體；過氧化物酶底物室溫下避光顯色；酶標(biāo)儀450/570 nm雙波長讀數(shù)，計算IgA1 型抗糖抗體濃度。

1.3 IgA腎病病理Lee 分級及牛津分型［4］

Lee 分級：Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級、Ⅴ級。牛津分型：即MEST 分型，系膜細(xì)胞增殖積分（M）、節(jié)段腎小球硬化或粘連（S）、毛細(xì)血管內(nèi)增生性病變（E）、間質(zhì)纖維化/腎小球萎縮（T）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用n（%）表示，使用χ2檢驗進(jìn)行比較；計量資料用（）表示，使用t檢驗進(jìn)行比較。兩變量間進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析；采用Logistics 回歸方程分析血漿抗糖抗體與臨床資料（尿酸、肌酐等）及牛津分析的相關(guān)性，繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析血漿抗糖抗體指標(biāo)在早期診斷IgA腎病中的應(yīng)用價值，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IgA 組與對照組患者臨床資料比較

兩組性別、年齡、BMI 指數(shù)、SBP、DBP 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；腎功能指標(biāo)以及血漿抗糖抗體指標(biāo)IgG、IgA1 型抗糖抗體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between the 2 groups［n（%），（±s）］

表1 兩組患者臨床資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between the 2 groups［n（%），（±s）］

臨床資料年齡（歲）性別（男/女）BMI（kg/m2）SBP（mmHg）DBP（mmHg）IgG 型抗糖抗體IgA1 型抗糖抗體血清胱抑肽C（mg/L）尿酸（μmol/L）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）24hUAER（g/24h）eGFR［mL/（min-1·（1.73 m2）-1］IgA 組（n=80）48.13±7.14 46/34 26.12±3.10 126.78±15.98 81.54±11.84 0.71±0.15 1.28±0.14 1.65±0.32 386.89±74.40 8.98±1.41 125.38±13.73 2.27±0.55 72.54±20.30對照組（n=80）46.18±6.73 42/38 25.84±3.27 124.79±14.30 83.18±11.74 0.38±0.10 1.12±0.10 0.85±0.21 219.45±56.87 5.26±1.05 62.85±20.62 1.13±0.22 104.51±10.27 χ2/t 值1.167 0.404 0.365 0.545 0.578 10.721 5.449 12.240 10.481 12.402 14.866 11.244 8.218 P 值0.248 0.525 0.716 0.588 0.283＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 血漿抗糖抗體指標(biāo)與IgA腎病病理分級的相關(guān)性

Pearson 的相關(guān)分析血漿抗糖抗體指標(biāo)IgG 型抗糖抗體與IgA腎病病理分級呈正相關(guān)（r=0.679，P=0.000），IgA1 型抗糖抗體與IgA腎病病理分級無統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.272，P=0.051）。見圖1。

圖1 IgG、IgA1 型抗糖抗體與IgA腎病病理分級相關(guān)性Figure 1 Correlation between IgG，IgA1 type anti-glycemic antibody and the pathological grade of IgA nephropathy

2.3 血漿抗糖抗體與尿酸的相關(guān)性

Pearson 的相關(guān)分析提示血漿抗糖抗體指標(biāo)IgG 型抗糖抗體與尿酸水平呈正相關(guān)（R=0.589，P=0.032），IgA1 型抗糖抗體與尿酸水平無統(tǒng)計學(xué)意義（R=0.114，P=0.073）。見圖2。

圖2 IgG、IgA1 型抗糖抗體與尿酸水平相關(guān)性Figure 2 Correlation between IgG-type，IgA1 type antiglycemic antibodies and uric acid levels

2.4 血漿抗糖抗體與牛津分級的相關(guān)性

根據(jù)IgA腎病牛津分型標(biāo)準(zhǔn)分為M、E、S、T。Pearson 的相關(guān)分析提示血漿抗糖抗體指標(biāo)IgG 型抗糖抗體與IgA腎病牛津分型呈正相關(guān)（r=0.752，P=0.024），IgA1 型抗糖抗體與IgA腎病牛津分型無顯著相關(guān)性（r=0.032，P=0.384）。見圖3。

圖3 IgG、IgA1 型抗糖抗體與牛津分型相關(guān)性Figure 3 Correlation between IgG，IgA1 type anti-glycemic antibodies and Oxford classification

2.5 血漿抗糖抗體指標(biāo)在早期診斷IgA腎病中的ROC 曲線

血漿IgG 型抗糖抗體診斷IgA腎病的AUC 為0.785（95%CI：0.708～0.862，P＜0.05），臨界值為0.550，敏感度為90.00%，特異度為65.00%。見圖4。

圖4 血漿抗糖抗體指標(biāo)在早期診斷IgA腎病中的ROC 曲線Figure 4 ROC curve of plasma anti-glycemic antibody indicators in the early diagnosis of IgA nephropathy

3 討論

IgA腎病是一種以IgA 沉積為主的常見腎小球腎炎。IgA腎病患者IgA1 鏈區(qū)氮乙酰半乳糖氨O(jiān)-糖基化程度降低，引起乙酰半乳糖氨暴露形成異常糖基化IgA1（Gd-IgA1），低糖基化的IgA可作為自身抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的IgA1-IgA1 和IgA1-IgG 免疫復(fù)合物，抗原、抗體或免疫復(fù)合物的形成和自聚集沉積于腎臟損傷腎功能［5-6］。有研究表明［7］，二聚體和IgA1 聚合物比單體更易聚集，這可能解釋了大分子IgA 在組織中聚集和沉積的傾向。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，對特定抗原改變的IgA 免疫反應(yīng)是導(dǎo)致IgA腎病中形成腎素性IgA 抗體復(fù)合物的原因［8］。雖然IgG 型抗糖抗體可能參與了大分子IgA 的形成，但沒有直接證據(jù)支持這一假設(shè)。

現(xiàn)有資料尚不能最終確定IgA腎病IgA 沉積物的來源，但多數(shù)認(rèn)為半乳糖缺陷型IgA 通過與RR Fcα/γ 相互作用，引起IgA 同型轉(zhuǎn)換的TGFβ、促進(jìn)產(chǎn)生IgA 的激活循環(huán)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分化［9］；另，IgA腎病系膜細(xì)胞增殖和基質(zhì)擴(kuò)張，這一過程依賴于IgA 誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞激活的觸發(fā)。研究表明［10］，IgA 復(fù)合物能夠激活細(xì)胞內(nèi)鈣離子、PLC-γ1 肌醇三磷酸，使蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化，激活人系膜細(xì)胞，使系膜細(xì)胞釋纖維原性轉(zhuǎn)化生長因子-β、白介素-6 等，介導(dǎo)IgA 產(chǎn)生。在Suzuki［11］的研究中發(fā)現(xiàn)IgA腎病單克隆IgG 抗體重鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)3 區(qū)氨基酸由丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸，其與Gd-IgA1 結(jié)合力下降，提示該區(qū)氨基酸的改變可導(dǎo)致IgG 型抗糖抗體與乙酰半乳糖氨的特異性親和力提高，增加IgA腎病抗體沉積。

Per?e 等［12］人在IgA腎病的腎小球及受損的組織中檢測到骨髓Gd-IgA1 受體FcαRI 的信使RNA。Suzuki H［13］的研究中指出，在IgA腎病的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量的Gd-IgA1 與跨膜FcαRI 結(jié)合產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，其結(jié)合水平與腎小球硬化呈相關(guān)性，而在IgA腎病患者表現(xiàn)出局灶節(jié)段性腎小球硬化相似的病理損害，推測IgG 型血漿抗糖抗體可能引發(fā)局灶性腎小球硬化。同時骨髓IgG 受體FcαRI 可通過啟動細(xì)胞因子、抗炎因子等機(jī)制介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，損傷腎功能［14］。另，在血尿酸異常的IgA腎病患者腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化更為嚴(yán)重，同時還可以通過激活RAS 系統(tǒng)引發(fā)腎小球損害，證實IgG 型抗糖抗體可能會引發(fā)或加重腎臟損害；促進(jìn)疾病的發(fā)展［15］。在補體系統(tǒng)方面IgA 可通過選擇性途徑和凝集素途徑激活該系統(tǒng)，在IgA腎病患者腎系膜區(qū)MBL 和MBL 相關(guān)絲氨酸蛋白酶與IgA 的沉積支持凝集素通路參與了IgA腎病的進(jìn)展。有學(xué)者［16-17］也證實了在IgA腎病中局部存在腎小球補體活化的作用。提示IgA腎病中IgG可能利用補體的局部激活和系膜細(xì)胞的激活促進(jìn)了腎損害的發(fā)生，促進(jìn)疾病的發(fā)展。

綜上所述，IgG、IgA1 型抗糖抗體在IgA腎病含量高于健康人群，推測抗糖抗體參與了IgA腎病的發(fā)生發(fā)展，且IgG 型抗糖抗體明顯優(yōu)于IgA1 型抗糖抗體，并可作為IgA腎病診斷指標(biāo)。同時本研究的不足之處在于血漿抗糖抗體水平僅代表單個時間點的水平，未對機(jī)體抗糖抗體水平進(jìn)行連續(xù)測量，另外由于樣本量較少且來源較單一，會影響研究結(jié)果，因此后期我們將進(jìn)行大樣本、多中心、連續(xù)時間點的研究。