急性髓系白血病患者CD73、DJ-1及LAMP4基因表達(dá)及意義

王萍 高紅秀 任曉艷 郭力 吳勝勝

作者單位：駐馬店市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，河南，駐馬店463000

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）又被稱作急性非淋巴細(xì)胞白血病或急性粒細(xì)胞白血病，是一種較為常見(jiàn)的造血系統(tǒng)惡性增生性疾病，疾病早期患者血細(xì)胞數(shù)目明顯減少，并引發(fā)發(fā)熱、倦怠、食欲減退等癥。目前，對(duì)于AML的發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，對(duì)于急性早幼粒細(xì)胞白血病患者通過(guò)系統(tǒng)治療近期生存率較高，而其他AML 患者多病情急重，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，因而尋找有效評(píng)估AML 病情預(yù)后的標(biāo)志物及相關(guān)治療靶點(diǎn)具有重要意義。CD73 為存在于細(xì)胞膜上的一類5′-核苷酸酶，與人體正常淋巴細(xì)胞的分化、發(fā)育有關(guān)。近年來(lái)研究顯示［1］，CD73 與急性白血病、慢性髓系白血病等患者預(yù)后存在密切聯(lián)系。DJ-1基因又被稱為PARK7基因，具有抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等多種功能，研究證實(shí)［2］，DJ-1基因表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，可作為惡性腫瘤的診斷及治療靶點(diǎn)。溶酶體相關(guān)膜蛋白（lysosome-associated membrane protein，LAMP）為溶酶體膜蛋白的主要組成成分，其中LAMP4 主要定位于內(nèi)膜系統(tǒng)，主要參與細(xì)胞的吞噬作用、細(xì)胞癌變等過(guò)程，在惡性腫瘤的診斷和預(yù)后研究中應(yīng)用較廣［3］。因此，本研究分析了AML患者CD73、DJ-1及LAMP4基因表達(dá)情況，以期為AML 的臨床診斷提供有效分子標(biāo)記及治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取駐馬店市中心醫(yī)院血液內(nèi)科2018年1月至2020年1月初診為AML 的70 例患者的骨髓標(biāo)本作為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)（第3 版）》［4］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②自愿參與本研究并簽署知情同意書(shū)；③非APL 患者采用IA方案化療；④均為初次確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤者；②無(wú)法配合研究進(jìn)行者；③肝腎等臟器功能異常者；④合并其他影響本研究結(jié)果的因素。其中，男39 例，女31 例，年齡平均（51.1±3.2）歲，依照FAB 標(biāo)準(zhǔn)［5］分為M0（5 例）、M1（6例）、M2（30 例）、M4（4 例）、M5（19 例）、M6（6例）。另選取10 例于本院行骨髓穿刺檢查的非血液系統(tǒng)腫瘤疾病的骨髓捐獻(xiàn)者骨髓穿刺標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男6 例，女4 例，年齡平均（49.6±3.4）歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 臨床指標(biāo)統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)所有患者性別、年齡、法國(guó)-美國(guó)-英國(guó)（French-American-British，F(xiàn)AB）白血病分型標(biāo)準(zhǔn)、貧血程度及世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）疾病危險(xiǎn)度分級(jí)［6］，并檢查血液白細(xì)胞、血小板、幼稚細(xì)胞組等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

1.2.2 CD73、DJ-1及LAMP4mRNA水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)CD73、DJ-1及LAMP4基因表達(dá)：所有患者入院確診后立即抽取2 mL 骨髓血，梯度離心20 min 獲得1～2×106個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞，PBS 洗滌，提取細(xì)胞總RNA。采用QuantiNova SYBR Green PCR Kit 試劑盒（購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司）提取總RNA，Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（購(gòu)自天根公司）逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。CD73、DJ-1及LAMP4 引物均由上海生物工程公司合成。CD73 引物序列，上游：5′-CACCAAGGTTCAGCAGATCCG-3′，下游：5′-GTTCATCAATGGGCGACCGG-3′。DJ-1 引物序列：上游：5′-GTGTAGCCGTGATGTGGTC-3′，下游：5′-GCT CCTTCAGTATCTCCTTCAC-3′。LAMP4 引物序列：上游：5′-GACAAGTACAACGTGAGCGG-3′，下游：5′-CGAGGTCTTGTTGGGGTTGA-3′。內(nèi)參照β-actin 引物序列，上游：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游：5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。熒光定量PCR 擴(kuò)增獲取溶解曲線、擴(kuò)增曲線，采用2-△△Ct計(jì)算CD73、DJ-1及LAMP4基因相對(duì)定量表達(dá)水平。

1.2.3 預(yù)后分析

依照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)（第3 版）》［4］中標(biāo)準(zhǔn)定義病人緩解定義為外周血象恢復(fù)，骨髓原始細(xì)胞＜5%。并根據(jù)緩解情況分為未緩解（none remission，NR）、部分緩解（partial remission，PR）和完全緩解（complete remission，CR）。所有患者隨訪6～36 個(gè)月，統(tǒng)計(jì)患者預(yù)后生存情況，計(jì)算生存率和中位生存時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組和對(duì)照組CD73、DJ-1及LAMP4基因表達(dá)水平比較

研究組CD73、DJ-1及LAMP4mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels between 2 groups（±s）

表1 兩組CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels between 2 groups（±s）

組別對(duì)照組研究組t 值P 值n 10 70 CD73 0.24±0.07 0.77±0.20 16.268 0.000 DJ-1 0.51±0.11 2.52±0.39 34.558 0.000 LAMP4 mRNA 0.28±0.07 0.42±0.09 4.710 0.000

2.2 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者臨床特征的相關(guān)性

CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 表達(dá)水平與患者性別、年齡、貧血程度、血小板計(jì)數(shù)、幼稚細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），與疾病危險(xiǎn)程度分級(jí)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、FAB 分型存在顯著相關(guān)性（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者臨床特征的相關(guān)性（±s）Table 2 Correlation between CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA and clinical characteristics of AML patients mRNA（±s）

表2 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者臨床特征的相關(guān)性（±s）Table 2 Correlation between CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA and clinical characteristics of AML patients mRNA（±s）

項(xiàng)目性別t 值P 值年齡t 值P 值FAB 分型F 值P 值貧血程度F 值P 值白細(xì)胞計(jì)數(shù)t 值P 值血小板計(jì)數(shù)F 值P 值幼稚細(xì)胞比例t 值P 值疾病危險(xiǎn)程度分級(jí)F 值P 值男女≤60＞60 M0 M1 M2 M4 M5 M6正常輕中度重度≤50＞50＜50 50～100＞100 0～0.5 0.5～1.0低中高n 39 31 49 21 5 6 3 0 4 1 9 67 49 14 50 20 46 12 12 23 47 21 37 12 CD73 0.78±0.22 0.75±0.20 0.590 0.557 0.76±0.17 0.77±0.23 0.202 0.840 0.64±0.20 0.65±0.22 0.94±0.20 0.63±0.18 0.77±0.23 0.61±0.20 8.699 0.000 0.77±0.22 0.74±0.21 0.79±0.25 0.186 0.854 0.59±0.17 0.83±0.22 4.894 0.000 0.78±0.19 0.72±0.23 0.77±0.23 0.155 0.877 0.76±0.15 0.78±0.26 0.610 0.544 0.52±0.14 0.63±0.18 0.96±0.22 7.041 0.000 DJ-1 2.55±0.43 2.51±0.37 0.411 0.682 2.46±0.47 2.53±0.41 0.592 0.556 2.30±0.29 2.31±0.36 2.96±0.62 2.33±0.35 2.70±0.28 2.25±0.21 9.153 0.000 2.50±0.42 2.53±0.44 2.54±0.41 0.219 0.829 2.33±0.36 3.19±0.47 8.253 0.000 2.51±0.45 2.55±0.51 2.56±0.39 0.387 0.700 2.52±0.44 2.53±0.41 0.094 0.926 2.16±0.24 2.33±0.34 2.98±0.42 6.209 0.000 LAMP4 mRNA 0.42±0.09 0.43±0.08 0.485 0.629 0.40±0.11 0.43±0.09 1.101 0.275 0.43±0.08 0.44±0.12 0.66±0.15 0.55±0.10 0.58±0.13 0.43±0.09 10.314 0.000 0.40±0.07 0.43±0.09 0.41±0.09 0.267 0.792 0.30±0.06 0.52±0.13 7.265 0.000 0.44±0.09 0.44±0.11 0.42±0.08 0.770 0.444 0.41±0.09 0.42±0.13 0.331 0.741 0.25±0.05 0.45±0.06 0.67±0.15 9.405 0.000

2.3 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者治療效果的相關(guān)性

70 例患者經(jīng)過(guò)治療后完全緩解率為74.3%（52/70），依照AML 患者入院確診后測(cè)定的CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 均值為分界線分為低于均值的低表達(dá)組和高于均值高表達(dá)組并對(duì)比顯示，CD73、DJ-1及LAMP4 低表達(dá)的AML 患者完全緩解率顯著高于高表達(dá)患者，且治療緩解后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 表達(dá)較治療前明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3～4。

表3 不同CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 表達(dá)水平治療后CR 比較［n（%）］Table 3 Comparison of CR after treatment with different expression levels of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA［n（%）］

2.4 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者預(yù)后的相關(guān)性

所有患者隨訪6～36 個(gè)月，平均（21.3±2.4）個(gè)月，預(yù)后良好的AML 患者入院確診后測(cè)定的CD73、DJ-1及LAMP4 較預(yù)后不良患者表達(dá)水平較低，且CD73、DJ-1及LAMP4 低表達(dá)的AML 患者總體生存率及中位生存時(shí)間顯著高于高表達(dá)患者（P＜0.05）。見(jiàn)表5～6。

表5 不同預(yù)后的AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 5 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients with different prognosis（±s）

表5 不同預(yù)后的AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 5 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients with different prognosis（±s）

項(xiàng)目預(yù)后良好預(yù)后不良t 值P 值n 52 18 CD73 0.48±0.08 0.83±0.12 11.520 0.000 DJ-1 1.96±0.26 2.71±0.47 6.438 0.000 LAMP4 mRNA 0.36±0.10 0.62±0.14 8.538 0.000

表4 治療緩解前后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 4 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients before and after treatment remission（±s）

表4 治療緩解前后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 4 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients before and after treatment remission（±s）

時(shí)間緩解前緩解后t 值P 值n 52 52 CD73 0.75±0.08 0.32±0.15 18.240 0.000 DJ-1 2.36±0.26 0.77±0.20 34.954 0.000 LAMP4 mRNA 0.41±0.10 0.31±0.10 5.099 0.012

3 討論

AML 以造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞異常增殖、分化受阻和凋亡抑制為主要特征的高度異質(zhì)性血液系統(tǒng)疾病，隨著遺傳學(xué)及分子醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，研究顯示基因突變、染色體易位及造血細(xì)胞免疫表型改變與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)AML 患者的治療反應(yīng)和預(yù)后均有一定的影響［7］。因此，研究AML 患者相關(guān)分子表達(dá)對(duì)于尋找患者個(gè)體化治療、基因治療的分子靶點(diǎn)及了解AML 的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)理等具有重要意義。

CD73 為分布于多種細(xì)胞細(xì)胞膜上的一類白細(xì)胞抗原，具有磷酸轉(zhuǎn)移酶和水解酶兩種酶活性，在維持核苷酸代謝平衡中具有重要作用。近年來(lái)報(bào)道顯示［8］，CD73 與白血病患者治療預(yù)后及分型相關(guān)；另有研究證實(shí)［9］，AML 患者核苷酸水解酶活性越強(qiáng)，患者白血病相關(guān)細(xì)胞分化程度越低，預(yù)后也越差。DJ-1 基因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn)的一類絲裂原依賴性癌基因，在胃癌、肝細(xì)胞癌等多種實(shí)體腫瘤中廣泛表達(dá)，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用［10-11］。研究顯示在初治急性白血病及骨髓增生異常綜合征患者的骨髓標(biāo)本中DJ-1基因表達(dá)水平明顯增加［12］。溶酶體為細(xì)胞質(zhì)中重要的細(xì)胞器，參與了細(xì)胞免疫、代謝、自噬等生理過(guò)程，LAMP4 為主要定位于溶酶體的巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)記物，可能通過(guò)調(diào)節(jié)AML 細(xì)胞的凋亡抑制和分化阻滯參與疾病的發(fā)生發(fā)展。研究指出［13］，LAMP4 在胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中高表達(dá)，并與惡性腫瘤患者臨床病理特征存在密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，在AML 患者骨髓標(biāo)本中CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 表達(dá)水平明顯高于正常人群的骨髓標(biāo)本。研究結(jié)果CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 表達(dá)水平與AML 患者臨床特征、疾病發(fā)展有著顯著關(guān)系，可能為AML 發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素，這與一些研究的結(jié)果相類似［14-16］。

表6 不同CD73、DJ-1及LAMP4 表達(dá)水平AML 患者總體生存率及中位生存時(shí)間比較Table 6 Comparison of overall survival rate and median survival time of AML patients with different expression levels of CD73，DJ-1 and LAMP4

本研究結(jié)果還顯示，CD73、DJ-1及LAMP4低表達(dá)的AML 患者完全緩解率顯著高于高表達(dá)患者，且治療緩解后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4表達(dá)較治療前明顯降低。同時(shí)，預(yù)后良好的AML患者CD73、DJ-1及LAMP4較其他患者表達(dá)水平較低，且CD73、DJ-1及LAMP4低表達(dá)的AML 患者總體生存率及中位生存時(shí)間顯著高于高表達(dá)患者。因此，AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4表達(dá)水平越高，患者治療效果及預(yù)后越差，而抑制CD73、DJ-1及LAMP4表達(dá)可延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，提升患者生存率。因而檢測(cè)CD73、DJ-1及LAMP4表達(dá)有助于AML 患者的診斷和預(yù)后判斷，但其具體的機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探討。綜上所述，AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4呈高表達(dá)，結(jié)合患者臨床特征及治療前后三指標(biāo)表達(dá)變化有助于判斷患者預(yù)后，并為臨床治療提供參考。