VEGF-C、CCL21及Bmi-1蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達及意義

惠志龍 張利萍 王龍影 王慧

作者單位：1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院婦科，河北，張家口075000

2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北，張家口075000

卵巢癌是威脅女性健康的一種惡性腫瘤，約占女性惡性腫瘤的3%～4%，其病死率位居婦科惡性腫瘤首位［1］。腫瘤侵襲性生長與轉(zhuǎn)移是導致患者預后不良的關(guān)鍵，而淋巴管的生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在其中扮演重要角色。血管內(nèi)皮細胞生長因子C（Vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）是一種重要的淋巴管生成因子，在促進新生淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移方面具有重要作用［2］。B 細胞特異性莫洛氏鼠白血病病毒插入位點-1（B-cell-specific Moloney leukemia virus insertion site-1，Bmi-1）是一種廣泛表達的核蛋白，參與細胞增殖的調(diào)控［3］。趨化因子與腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移有關(guān)，相關(guān)研究顯示，肺癌、乳腺癌及卵巢癌中均有趨化因子及其受體的表達增高，其中趨化因子21 主要由淋巴管內(nèi)皮細胞分泌，在卵巢癌淋巴轉(zhuǎn)移中具有重要作用［4］。基于此，本研究通過檢測VEGF-C、C-C 趨化因子配體（C-C chemokine ligand，CCL21）及Bmi-1 在上皮性卵巢癌組織中的表達情況，探討其表達及與微淋巴管生成、患者預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河北北方學院附屬第一醫(yī)院2017年1月至2020年1月收治的82 例上皮性卵巢癌患者術(shù)中所取癌組織納入研究組，平均年齡為（47.56±9.36）歲；臨床分期：Ⅰ期16 例，Ⅱ期12 例，Ⅲ期30例，Ⅳ期24 例；病理類型：漿液性癌43 例，黏液性癌39 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)56 例；病理分級G116 例，G231 例，G335 例。納入標準：①均符合上皮性卵巢癌的診斷標準［5］；②初次手術(shù)者；③臨床資料無缺失或丟失；④未進行化療、放療等治療者。排除標準：①心臟、肝腎功能不全；②合并免疫功能、血液功能障礙者；③合并其他惡性疾?。虎苤型就顺稣?。并選取距癌組織3 cm 處的癌旁組織作為對照組。本研究經(jīng)院醫(yī)學倫理委員會批準通過，受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

鼠抗人VEGF-C 單克隆抗體，購自美國Neomarkers 公司；兔抗人CCL21 多克隆抗體，購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；兔抗人Bmi-1 單克隆抗體，購自上海生物技術(shù)有限公司。鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（SP）免疫組化超敏試劑盒、胰蛋白酶及二氨基聯(lián)苯氨酶底物顯色試劑盒均購自福州邁新公司。

1.2.2 檢測方法

標本均在手術(shù)后立即采集，用10%甲醛溶液固定后，常規(guī)脫水石蠟包埋。根據(jù)S-P 免疫組化染色法對VEGF-C、CCL21及Bmi-1蛋白進行檢測，檢測過程嚴格按照說明書進行。一抗陰性對照使用PBS（磷酸鹽緩沖液）進行代替。

1.2.3 結(jié)果判斷［6］

根據(jù)陽性細胞百分比、染色強度判定。①陽性標準為在細胞核或細胞漿內(nèi)出血棕黃色或褐色顆粒。0 分為無色，1 分淡黃色，棕黃色2 分，棕褐色3 分。②陽性細胞率計算：從每張切片中隨機選取5 個高倍視野并計算陽性細胞數(shù)，陽性細胞率=陽性細胞數(shù)/觀察細胞數(shù)×100%。0 分：無陽性細胞，1 分：陽性細胞＜10%，2 分：10%～50%，3 分：50%～75%，4 分：＞75%?？偡e分：上述2 項評分的乘積。陽性：總積分＞4 分。

1.2.4 微淋巴管密度（Microlymphatic vessel densit，LVD）計數(shù)

采用低倍顯微鏡（×100）觀察經(jīng)SP 染色后切片，尋找LVD 相對最高處，即熱點位置，隨后在高倍顯微鏡（×400）下計數(shù)，D2-40定位于淋巴管內(nèi)皮細胞胞漿或胞膜，呈棕色，對于著色內(nèi)皮細胞或淋巴管內(nèi)皮簇，只要它們和鄰近的染色的淋巴管、腫瘤細胞或其他結(jié)締組織分開，即可作為一個淋巴管計數(shù)，記錄5個視野內(nèi)的微淋巴管數(shù)，取其最高數(shù)作為LVD值［7］。

1.3 隨訪

以病例查詢、電話或門診復查的方式對患者進行1年隨訪（截止時間2021年1月），分析影響其56預后生存的危險因素。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用n（%）表示，采用χ2檢驗；采用Pearson 法對各參數(shù)進行相關(guān)性分析；采用多元Logistic 回歸分析影響上皮性卵巢癌患者1年預后生存的相關(guān)危險因素，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C、CCL21及Bmi-1 在各組的表達情況

研究組VEGF-C、CCL21及Bmi-1 陽性表達率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 VEGF-C、CCL21及Bmi-1 在各組的表達情況［n（%）］Table 1 expression of VEGF-C，CCL21 and Bmi-1 in each group［n（%）］

圖1 免疫組化圖（SP，×400）Figure 1 Immunohistochemistry map（SP，×400）

2.2 上皮性卵巢癌病理特征與VEGF-C、CCL21、Bmi-1及LVD 的關(guān)系

上皮性卵巢癌臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級G3級者VEGF-C、CCL21 陽性表達率顯著高于上皮性卵巢癌臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級G1～G2級者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。上皮性漿液性卵巢癌、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Bmi-1 陽性表達率更高（P＜0.05）；且上皮性漿液性卵巢癌、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級G3級者LVD 值更高（P＜0.05）。見表2。

表2 上皮性卵巢癌病理特征與VEGF-C、CCL21、Bmi-1及LVD 的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 2 Relationship between pathological features of epithelial ovarian cancer and VEGF-C，CCL21，Bmi-1 and LVD［n（%），（±s）］

表2 上皮性卵巢癌病理特征與VEGF-C、CCL21、Bmi-1及LVD 的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 2 Relationship between pathological features of epithelial ovarian cancer and VEGF-C，CCL21，Bmi-1 and LVD［n（%），（±s）］

病理特征年齡腫瘤直徑組織學類型臨床分期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病理分級＜45 歲≥45 歲＜10 cm≥10 cm漿液性黏液性Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ有無G1-G2 G3 n 38 44 32 50 43 39 28 54 56 22 47 35 VEGF-C 陽性22（44.00）28（56.00）19（38.00）31（62.00）29（58.00）21（42.00）12（24.00）38（76.00）41（82.00）9（18.00）21（42.00）29（58.00）χ2值0.328 0.057 1.589 5.866 7.163 12.287 P 值0.567 0.812 0.208 0.015 0.007＜0.001 CCL21 陽性26（44.83）32（55.17）22（37.93）36（62.07）33（56.90）25（43.10）13（22.41）45（77.59）46（79.3）12（20.69）25（43.10）33（56.90）χ2值0.183 0.100 1.579 12.131 6.309 16.365 P 值0.669 0.752 0.209＜0.001 0.012＜0.001 Bmi-1 陽性26（46.43）30（53.57）25（44.64）31（55.36）35（62.50）21（37.50）13（23.21）43（76.79）44（78.57）12（21.43）36（64.29）20（35.71）χ2值0.001 2.3430.126 7.1680.007 9.3870.002 4.5030.034 0.5390.463 P 值0.981 LVD 值12.07±3.02 11.59±2.98 12.15±3.34 11.06±2.38 12.78±3.69 10.89±1.32 9.29±1.88 15.45±3.47 15.72±4.89 8.88±2.94 10.11±3.45 16.21±4.77 χ2值0.723 1.7250.088 3.0170.003 8.735 6.126 6.723 P 值0.472＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 VEGF-C、CCL21、Bmi-1 與LVD 的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，VEGF-C（r=0.647）、CCL21（r=0.584）及Bmi-1（r=0.576）與LVD 均呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

2.4 影響上皮性卵巢癌患者預后的單多因素分析

臨床分期（Ⅲ～Ⅳ期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有）、病理分級（G3）、VEGF-C（陽性）、CCL21（陽性）及Bmi-1（陽性）為影響上皮性卵巢癌患者預后生存的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響上皮性卵巢癌患者預后的單多因素分析Table 3 univariate and multivariate analysis of prognosis in patients with epithelial ovarian cance

3 討論

上皮性卵巢癌是臨床常見惡性疾病，早期無特異性癥狀，大部分患者就診已是晚期，預后不佳［8］。目前淋巴管形成已成為國內(nèi)外研究熱點，已有臨床研究證實，淋巴管形成是卵巢癌惡性進展的關(guān)鍵步驟［9］。因此需對上皮性卵巢癌發(fā)病、發(fā)展機制進行研究，并尋找、開發(fā)新治療靶點以改善上皮性卵巢癌患者預后。

VEGF-C 是近年來發(fā)現(xiàn)的介導腫瘤淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因子，其可通過調(diào)節(jié)原有淋巴管內(nèi)皮細胞間的細胞分泌方式，促進原有淋巴管增生，并與新生淋巴管相互吻合，形成淋巴管網(wǎng)，使得腫瘤細胞通過淋巴管間的吻合進入淋巴管，并發(fā)生轉(zhuǎn)移，影響患者預后［10-11］。已有多項研究表明，VEGF-C 與卵巢癌、胰腺癌及乳腺癌等多種惡性疾病的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預后有著密切的相關(guān)性［12］。CCL21 是一種主要表達于外周免疫器官或組織的趨化因子，通過作用于趨化因子受體7，介導淋巴細胞與經(jīng)抗原分化的樹突狀細胞進入淋巴管。Cunnea 等［13］報道發(fā)現(xiàn)，在肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中CCL21 呈高表達，并促進了腫瘤細胞增值、分化，CCL21 參與了癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程。Bmi-1是多梳基因家族成員之一，在白血病、淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。國外有研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1在多數(shù)人體正常組織中無表達或呈低表達，在多種腫瘤組織或細胞中表達明顯上調(diào)，且與患者預后不良有關(guān)，被認為是一種潛在的癌基因［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C、CCL21及Bmi-1 在正常組織中的陽性表達率均顯著低于上皮性卵巢癌組織。進一步分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)的臨床晚期（Ⅲ～Ⅳ期）Bmi-1 呈過度表達，僅少數(shù)臨床早期（Ⅰ～Ⅱ期）者VEGF-C、CCL21及Bmi-1 呈過度表達。國外報道顯示，VEGF-C、CCL21及Bmi-1 高表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、病理分級有關(guān)［15］。但本研究上述因子中僅Bmi-1 高表達與患者病理類型有關(guān)，VEGF-C、CCL21 表達與患者病理類型無顯著相關(guān)性，分析其原因可能與樣本量納入偏少、患者自身因素等有關(guān)。此外本研究通過分析VEGF-C、CCL21及Bmi-1 與LVD 相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，VEGF-C、CCL21及Bmi-1 均與LVD 呈顯著正相關(guān)。上述結(jié)論均提示，VEGF-C、CCL21及Bmi-1蛋白過度表白可能在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中擔當重要作用，參與了部分腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性進程。本研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF-C、CCL21及Bmi-1 陽性表達均是影響上皮性卵巢癌患者預后生存的危險因素。推測可能是由于VEGF-C、CCL21及Bmi-1 過度表達可刺激微淋巴管生成，癌細胞通過脈管間隙侵入脈管系統(tǒng)而導致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，影響患者預后。

綜上所述，上皮性卵巢癌VEGF-C、CCL21及Bmi-1 過度表達可能促進微淋巴管生成，是影響患者預后不良的危險因素。