人類白細(xì)胞抗原基因分型檢測(cè)試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的修訂與驗(yàn)證

胡澤斌 王瑞霞 代蕾穎 曲守方★ 黃杰★

作者單位：1.中國(guó)食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所，北京100050

2.北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，北京101111

人類白細(xì)胞抗原（Human Leucocyte Antigen，HLA）的I 類A、B、C 位點(diǎn)和II 類DR、DQ 位點(diǎn)等位基因的分型檢測(cè)在造血干細(xì)胞移植，骨髓移植以及肝臟腎臟等其他組織器官移植的供體受體配型中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1-2］。同時(shí)HLA-I 類B 座位的單位點(diǎn)如B27 和B5801 等基因分型檢測(cè)在強(qiáng)制性脊柱炎的輔助診斷和痛風(fēng)用藥指導(dǎo)中也發(fā)揮重要作用［3-4］。目前，在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局取得醫(yī)療器械注冊(cè)證的HLA 基因分型檢測(cè)試劑盒約有十種，方法學(xué)包含聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）、聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性寡核苷酸探針法（polymerase chain reaction- sequence specific oligonucleotide，PCR-SSO）、基因測(cè)序分型法（sequence based genotyping，PCR-SBG）、熒光PCR 法等［5-7］。2010年原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1180-2010《人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因分型試劑盒（SSP 法）》［8］，為分子診斷領(lǐng)域較早制定的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，僅針對(duì)當(dāng)時(shí)較為流行的SSP 方法學(xué)的HLA 基因分型試劑盒，隨著HLA產(chǎn)品多樣性的增加，原條款適用性降低，按照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2020年醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃［9］，對(duì)其進(jìn)行修訂。本研究選取16 批次不同方法學(xué)的HLA 基因分型試劑盒，對(duì)擬定標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)指標(biāo)和檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 核酸分型檢測(cè)試劑盒（PCR-SBT 法），由德必碁生物科技（廈門）有限公司提供；HLA-A、B、C、DR、DQ 位點(diǎn)分型檢測(cè)試劑盒（SSO 法），由北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司提供；人類白細(xì)胞抗原B*5801 核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法），人類白細(xì)胞抗原B*1502 核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法），人類白細(xì)胞抗原B*27 基因分型試劑盒（SSP 法），由江蘇偉禾生物科技有限公司提供；HLA-B27 基因檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 探針法），由山東英盛生物技術(shù)有限公司提供；人類白細(xì)胞抗原B27 核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法），由江蘇默樂生物科技股份有限公司提供；HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 位點(diǎn)分型檢測(cè)試劑盒（SBT 法），HLA-A、B、C、DR、DQ 位點(diǎn)分型檢測(cè)試劑盒（SSP 法），HLA-A、B、C、DR、DQ 位點(diǎn)分型檢測(cè)試劑盒（SSO 法），由賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司提供。人類白細(xì)胞抗原B27 核酸檢測(cè)國(guó)家參考品（批號(hào)：360035-201901，10 支/套，30 μL/支，20 ng/μL），由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；人類白細(xì)胞抗原B5801/5701/1502 核酸檢測(cè)國(guó)家參考品（批號(hào)：360036-201901，20 支/套，30 μL/支，20 ng/μL），由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；人類白細(xì)胞抗原組織配型基因分型國(guó)家參考品（批號(hào)：360045-202001，38 支/套，30 μL/支，20 ng/μL），由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.1.2 儀器

ABI 7500 熒光定量基因擴(kuò)增儀由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；ABI GeneAmpPCR System，上海天能凝膠成像儀，由江蘇偉禾生物科技有限公司提供；luminex200 多功能流式點(diǎn)陣儀由北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司提供；ABI 3730XL 分析儀由德必碁生物科技（廈門）有限公司提供；SLAN-96P 全自動(dòng)醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)由江蘇默樂生物科技股份有限公司提供；Thermofisher DNA分析儀，Alpha Imager 凝膠成像系統(tǒng)由賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司提供。

1.2 方法

按照修訂后的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因分型試劑盒》進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證的技術(shù)指標(biāo)包括外觀、參考品符合率、重復(fù)性、有效檢測(cè)范圍、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、特異性、檢出限。

1.2.1 外觀

目測(cè)檢查外觀，包括試劑盒的完整性、效期、包裝信息、是否有人為損傷。

1.2.2 與移植或輸血的供體與受體匹配相關(guān)試劑盒的性能要求

1.2.2.1 參考品符合率 對(duì)HLA 基因分型國(guó)家參考品或者企業(yè)參考品進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)與已知基因分型結(jié)果相符合。

1.2.2.2 重復(fù)性 將1～3 份具有代表性的DNA 樣品進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品平行檢測(cè)3～5 次，檢測(cè)的結(jié)果應(yīng)一致且與已知基因分型結(jié)果相符合。

1.2.2.3 有效檢測(cè)范圍 用試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的陽性參考品，分別配制出最高和最低兩個(gè)濃度進(jìn)行檢測(cè)，均應(yīng)與已知基因型別相符合。

1.2.2.4 穩(wěn)定性 可選用效期穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)行參考品符合率和有效檢測(cè)范圍項(xiàng)目的驗(yàn)證。

1.2.3 疾病輔助診斷相關(guān)試劑盒的性能要求

1.2.3.1 準(zhǔn)確性 對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)已知基因分型的國(guó)家或企業(yè)陽性參考品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)為陽性或相應(yīng)基因型。

1.2.3.2 特異性 對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍外的國(guó)家或企業(yè)陰性參考品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性或未檢出。

1.2.3.3 重復(fù)性 對(duì)1～3 份陽性參考品平行進(jìn)行檢測(cè)5～10 次，結(jié)果應(yīng)均為陽性或相應(yīng)基因型；對(duì)1～3 份陰性參考品平行進(jìn)行檢測(cè)5～10 次，結(jié)果應(yīng)均為陰性或未檢出。

1.2.3.4 檢出限 對(duì)檢出限參考品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)為陽性或相應(yīng)基因型。

1.2.3.5 穩(wěn)定性 可選用效期穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確性、特異性、檢出限、4 項(xiàng)目的驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 外觀驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)6 家共16 批次HLA 基因分型檢測(cè)試劑盒，依據(jù)擬定HLA 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的上述性能指標(biāo)進(jìn)行了全部驗(yàn)證，所有試劑盒的各組份齊全、完整，液體無滲漏；包裝標(biāo)簽應(yīng)清晰，無磨損，外觀均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.2 與移植或輸血的供體與受體匹配相關(guān)試劑盒的性能驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 參考品符合率驗(yàn)證結(jié)果

3 家企業(yè)的HLA-A、B、C、DR、DQ 位點(diǎn)分型檢測(cè)試劑盒（SBT 法和SSO 法）對(duì)人類白細(xì)胞抗原組織配型基因分型國(guó)家參考品的38 支人基因組DNA 樣品，全部進(jìn)行參考品符合率檢測(cè)，在制造商宣稱的分辨率水平上，驗(yàn)證結(jié)果與國(guó)家參考品已知基因分型結(jié)果相符合，結(jié)果均符合規(guī)定。

2.2.2 重復(fù)性和有效檢測(cè)范圍驗(yàn)證結(jié)果

采用2 種方法學(xué)的HLA-A、B、C、DR、DQ 位點(diǎn)分型檢測(cè)試劑盒（SSP 法和SSO 法），對(duì)3 份已知基因分型的具有代表性的重復(fù)性參考品進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品平行檢測(cè)3 次，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)一致，且在制造商宣稱的分辨率水平上與已知基因分型結(jié)果相符合。

對(duì)2 份試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)已知基因分型的企業(yè)陽性參考品，分別配制出高、低2 個(gè)濃度后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均在試劑盒制造商宣稱的分辨率水平上與已知基因型別相符合。

2.2.3 穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

采用2 種方法學(xué)的HLA-A、B、C、DR、DQ 位點(diǎn)分型檢測(cè)試劑盒（SSP 法和SSO 法）對(duì)效期穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，參考品符合率和有效檢測(cè)范圍均符合擬定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，見表1。

表1 與移植或輸血的供體與受體匹配相關(guān)試劑盒的部分驗(yàn)證結(jié)果Table 1 Partial verification results of related kits matched with donors and recipients for transplantation or blood transfusion

2.3 疾病輔助診斷相關(guān)試劑盒的性能驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 HLA-B27 基因檢測(cè)試劑盒的性能驗(yàn)證結(jié)果

采用3 家共4 批次HLA-B27 基因檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法和SSP 法），對(duì)人類白細(xì)胞抗原B27核酸檢測(cè)國(guó)家參考品的10 支人基因組DNA 樣品全部進(jìn)行了準(zhǔn)確性和特異性檢測(cè)，試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)已知基因分型的國(guó)家陽性參考品檢測(cè)結(jié)果均陽性或相應(yīng)基因型。

試劑盒檢測(cè)范圍外的國(guó)家陰性參考品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性；同時(shí)對(duì)2 家的企業(yè)陽性參考品和企業(yè)陰性參考品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果全部符合規(guī)定；重復(fù)性和檢出限項(xiàng)目中，采用2 家2 批次HLA-B27 基因檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法），對(duì)陽性重復(fù)性參考品平行進(jìn)行檢測(cè)10 次，結(jié)果一致均為陽性，對(duì)陰性重復(fù)性參考品平行進(jìn)行檢測(cè)10 次，結(jié)果一致應(yīng)均為陰性，對(duì)檢出限參考品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果均檢出陽性；穩(wěn)定性項(xiàng)目中，采用2 家2 批次HLA-B27 基因檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法），對(duì)效期穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，準(zhǔn)確性、特異性和檢出限均符合擬定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，見表2。

表2 疾病輔助診斷相關(guān)試劑盒的部分驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Partial verification results of related kits for auxiliary diagnosis of diseases

2.3.2 HLA-B1502 和B5801 基因檢測(cè)試劑盒的性能驗(yàn)證結(jié)果

在疾病輔助診斷相關(guān)試劑盒的性能要求中，采用1 家各1 批次的HLA-B1502 和B5801 試劑盒（PCR 法），對(duì)人類白細(xì)胞抗原B5801/5701/1502 核酸檢測(cè)國(guó)家參考品的20 支人基因組DNA 樣品全部進(jìn)行了準(zhǔn)確性和特異性檢測(cè)，試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)已知基因分型的國(guó)家陽性參考品檢測(cè)結(jié)果均為陽性；試劑盒檢測(cè)范圍外的國(guó)家陰性參考品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性；重復(fù)性和檢出限項(xiàng)目中，還采用1 批次HLA-B5801 試劑盒，對(duì)陽性重復(fù)性參考品平行進(jìn)行檢測(cè)10 次，結(jié)果一致均為陽性，對(duì)陰性重復(fù)性參考品平行進(jìn)行檢測(cè)10 次，結(jié)果一致應(yīng)均為陰性，對(duì)檢出限參考品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果均檢出陽性；穩(wěn)定性項(xiàng)目中，還采用1 批次HLA-B5801 試劑盒對(duì)效期穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，準(zhǔn)確性、特異性和檢出限均符合擬定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3 討論

隨著體外診斷分子檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展和對(duì)HLA 科學(xué)研究的不斷深入，臨床上涌現(xiàn)出更多更豐富的HLA 基因分型試劑盒。從臨床預(yù)期用途來說，此類試劑盒主要有兩大類，一類是用于組織器官和干細(xì)胞移植供受體配型的A、B、C、DRB、DQB 位點(diǎn)的HLA 分型試劑，方法學(xué)上有低分辨率、中分辨率的SSP 法和SSO 法，還有高分辨率的SBT 法；另一類是用于疾病輔助診斷或臨床用藥指導(dǎo)的HLA 單位點(diǎn)核酸檢測(cè)試劑盒［10-11］，如與強(qiáng)制性脊柱炎密切相關(guān)的B27，與治療痛風(fēng)常用藥別嘌呤醇過敏相關(guān)的HLA-B5801，與抗艾滋病經(jīng)典藥物阿巴卡韋超敏反應(yīng)相關(guān)的HLA-B5701，與抗癲癇藥卡馬西平藥物引起的史蒂芬瓊森癥候群相關(guān)的HLA-B1502 等基因檢測(cè)，這類試劑盒在方法學(xué)上主要以PCR 為主，包括熒光PCR 法、PCR 探針法、PCR 熔解曲線法等。

原行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1180-2010 人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因分型試劑盒（SSP 法）于2010年12月27日發(fā)布并于2012年6月1日實(shí)施，僅適用于SSP法檢測(cè)HLA 基因分型試劑盒，而該方法學(xué)的試劑盒主要用于HLA的I類A、B、C位點(diǎn)和Ⅱ類DRB、DQB位點(diǎn)的低分辨率、中分辨率的基因分型。為拓展行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍，提高各類HLA 基因分型檢測(cè)試劑的產(chǎn)品質(zhì)量，更好滿足監(jiān)管需要，本次修訂標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，根據(jù)HLA基因分型產(chǎn)品臨床預(yù)期用途和性能指標(biāo)的不同，對(duì)產(chǎn)品指標(biāo)做了分類。在技術(shù)指標(biāo)的確定方面，參考了目前市場(chǎng)上進(jìn)口企業(yè)和國(guó)產(chǎn)企業(yè)廠家相關(guān)產(chǎn)品的說明書和性能評(píng)估資料，并結(jié)合臨床要求制定，業(yè)內(nèi)專家對(duì)逐條性能指標(biāo)進(jìn)行了充分討論。并且對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中每一條性能指標(biāo)和試驗(yàn)方法均進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，關(guān)鍵指標(biāo)準(zhǔn)確性和特異性采用了相應(yīng)的HLA國(guó)家參考品［12-14］進(jìn)行考察，如上所述，驗(yàn)證結(jié)果全部符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要求。綜上，修訂后的HLA 產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)所列技術(shù)指標(biāo)是合理的，所列試驗(yàn)方法是可靠的可行的。