PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5在晚期乳腺癌放療過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及意義

寸倩瀅 張思榮 唐恩躍

作者單位：保山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南，保山678000

據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌發(fā)生率居于全球范圍內(nèi)女性惡性腫瘤首位，此類患者轉(zhuǎn)移后的5年生存率僅為27%甚至更低［1-2］。近年來，隨著放療技術(shù)進(jìn)展，放療患者總體生存狀況得到顯著改善。但腫瘤在分子基因水平方面存在高度異質(zhì)性，從而導(dǎo)致放療效果出現(xiàn)明顯差異［3］。程序性細(xì)胞死亡配體1（Programmed cell death ligand 1，PD-L1）通路在乳腺癌中存在活性，參與免疫介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［4］。人類白細(xì)胞抗原-B（Human leukocyte antigen-B，HLA-B）缺失表達(dá)是多種腫瘤發(fā)生的重要因素［5］。研究證實(shí)，腫瘤組織中存在多藥耐藥相關(guān)蛋白（Multidrug resistance associated proteins，MRP），其中MBP5 參與腫瘤發(fā)生進(jìn)展，并與腫瘤復(fù)發(fā)有一定關(guān)系［6］。但關(guān)于三者在晚期乳腺癌放療過程中的監(jiān)測(cè)價(jià)值仍缺乏循證依據(jù)。為此，本研究嘗試探究外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中PD-L1、MRP5、HLA-B 在晚期乳腺癌放療過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及意義。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取保山市人民醫(yī)院2018年1月至2021年1月122 例晚期乳腺癌患者，其中年齡平均年齡（52.17±7.61）歲；體質(zhì)量指數(shù)平均（22.06±1.81）kg/m2；臨床分期：ⅢB 期72 例，Ⅳ期50 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理檢查證實(shí)為乳腺癌；均具備放療指征；患者及家屬均知情，簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：參與本研究前接受抗腫瘤、免疫抑制治療者；伴有自身免疫性疾病者；存在急慢性嚴(yán)重感染者；妊娠期、哺乳期女性；合并血液系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

所有患者均行放療，采用直線加速器6 MVX射線與9 MEV 電子線，根據(jù)腫瘤分期、病理類型［7］等確定放療區(qū)域，照射劑量為2 Gy/次，5 次/周，總量直至50 Gy。以21 d 為1 個(gè)療程，共放療2 個(gè)療程。放療結(jié)束后4 周評(píng)估療效，腫瘤病灶完全消失，持續(xù)時(shí)間≥4 周為完全緩解；腫瘤病灶縮小幅度≥50%，且持續(xù)時(shí)間≥4 周為部分緩解；介于部分緩解與進(jìn)展之間為穩(wěn)定；腫瘤病灶增大幅度≥25%為進(jìn)展。將完全緩解、部分緩解納入有效組，穩(wěn)定、進(jìn)展納入無效組［8］，分為有效組（74 例）與無效組（48 例）。

1.2.2 檢測(cè)方法

采集靜脈血30 mL，肝素抗凝，采用Hark's 液稀釋1 倍，緩慢加到NycoprepTM1.077A 人淋巴細(xì)胞分離液上，離心處理，2 000 r/min，離心20 min 離心半徑（13.5 cm），吸取中間白膜層，提取PBMC。采用Trizol 裂解PBMC，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Real-time PCR Master Mix kit 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)，引物由廣州伯信生物科技有限公司合成，反應(yīng)條件：95℃60 s，95℃15 s，40 個(gè)循環(huán)，60℃60 s。采用△△Ct 法相對(duì)定量分析PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA 表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均確認(rèn)具備方差齊性且近似服從正態(tài)布，以（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman/Pearson 相關(guān)系數(shù)模型；預(yù)測(cè)價(jià)值采用受試者工作特征（ROC）曲線分析，獲取曲線下面積、置信區(qū)間、敏感度、特異度及截?cái)嘀?，?lián)合診斷實(shí)施Logistic 二元回歸擬合，返回預(yù)測(cè)概率logit（p），將其作為獨(dú)立檢驗(yàn)變量。P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA水平比較

放療1 個(gè)療程、放療結(jié)束后PBMC中PD-L1、MRP5mRNA水平低于放療前，HLA-BmRNA 高于放療前（P＜0.05）。見表1。

表1 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of PD-L1，HLA-B and MRP5 mRNA in PBMC before and after radiotherapy（±s）

表1 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of PD-L1，HLA-B and MRP5 mRNA in PBMC before and after radiotherapy（±s）

注：與放療前比較，aP＜0.05。

組別放療前放療1 個(gè)療程放療結(jié)束后F 值P 值n 122 122 122 PD-L1 mRNA 1.48±0.22 1.27±0.18a 1.09±0.12a 146.477＜0.001 HLA-B mRNA 0.34±0.08 0.43±0.12a 0.52±0.15a 68.467＜0.001 MRP5 mRNA 5.12±0.67 4.56±0.52a 4.23±0.34a 88.742＜0.001

2.2 兩組放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA及差值

有效組放療1 個(gè)療程、放療結(jié)束后PBMC中PD-L1、MRP5mRNA水平低于無效組，HLA-BmRNA水平高于無效組，放療前與放療結(jié)束后PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA 差值絕對(duì)值高于無效組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 表達(dá)量及差值比較（±s）Table 2 Comparison of PD-L1，HLA-B，MRP5 mRNA and difference between two groups before and after radiotherapy（±s）

表2 兩組放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 表達(dá)量及差值比較（±s）Table 2 Comparison of PD-L1，HLA-B，MRP5 mRNA and difference between two groups before and after radiotherapy（±s）

指標(biāo)PD-L1 mRNA HLA-B mRNA MRP5 mRNA組別無效組有效組t 值P 值無效組有效組t 值P 值無效組有效組t 值P 值例數(shù)48 74 48 74 48 74放療前1.52±0.53 1.45±0.44 0.791 0.430 0.33±0.11 0.35±0.12 0.929 0.355 5.15±1.09 5.10±1.04 0.255 0.800放療1 個(gè)療程后1.42±0.47 1.18±0.63 2.261 0.026 0.35±0.12 0.48±0.16 4.816＜0.001 5.03±1.01 4.25±0.73 4.947＜0.001放療結(jié)束后1.35±0.45 0.92±0.21 7.122＜0.001 0.40±0.14 0.59±0.20 5.730＜0.001 4.76±0.94 3.88±0.61 6.276＜0.001放療前與放療結(jié)束后差值0.17±0.06 0.53±0.20 12.107＜0.001-0.07±0.03-0.24±0.08 14.078＜0.001 0.39±0.13 1.22±0.44 12.698＜0.001

2.3 PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 放療前與放療結(jié)束后差值相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析，PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5mRNA水平放療前與放療結(jié)束后差值絕對(duì)值呈正相關(guān)（r=0.632、0.650、0.731，P均＜0.05）。

2.4 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 差值與療效的關(guān)系

Spearman 相關(guān)性分析，放療前與放療結(jié)束后PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA 差值絕對(duì)值與療效呈正相關(guān)（r=0.711、0.726、0.803，P＜0.05）。

2.5 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA水平差值對(duì)療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

以無效組作為陽性樣本，有效組作為陰性樣本，繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，放療前與放療結(jié)束后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5mRNA 差值絕對(duì)值預(yù)測(cè)療效的AUC 分別為0.896、0.901、0.908，聯(lián)合預(yù)測(cè)療效的AUC 為0.951，95%CI 為0.906-0.996，敏感度為91.67%，特異度為91.89%，優(yōu)于各指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測(cè)，見表3、圖1。

圖1 ROC 曲線圖Figure 1 ROC curve

表3 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 表達(dá)量差值對(duì)療效的預(yù)測(cè)價(jià)值Table 3 the predictive value of PD-L1，HLA-B，MRP5 mRNA difference in PBMC before and after radiotherapy for curative effect

3 討論

近年來，臨床在乳腺癌篩查、治療及生存方面取得較大進(jìn)展，但乳腺癌仍是45 歲以下女性最主要的癌癥死因。放療在減少乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、改善預(yù)后方面具有重要作用。但臨床實(shí)踐證實(shí)，即使臨床病理特征相同的乳腺癌患者在接受相同放療方案治療后，效果也會(huì)存在差異［9］。因此，在放療期間監(jiān)測(cè)相關(guān)指標(biāo)變化情況成為臨床預(yù)測(cè)放療效果、調(diào)整治療方案的重要途徑。

PD-L1 通路在多種癌癥中均扮演活躍的免疫檢查點(diǎn)的角色。PD-L1 作為一種跨膜蛋白，能夠結(jié)合活化細(xì)胞毒性T 細(xì)胞表面表達(dá)的PD-1 受體，阻滯T 細(xì)胞活化及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制CD3/CD28 介導(dǎo)的T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程，從而促使腫瘤細(xì)胞逃避T 淋巴細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)而加快腫瘤細(xì)胞生長、增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者放療后PBMC中PD-L1mRAN 較治療前明顯下降，主要是由于PD-LI 通路在參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中會(huì)引起葡萄糖代謝、蛋白激酶的激活、磷脂酰肌醇激酶的磷酸化等一系列生化反應(yīng)，而放療過程中細(xì)胞代謝通路廣泛參與免疫識(shí)別與凋亡細(xì)胞的清除，導(dǎo)致PD-L1 表達(dá)下調(diào)［10］。乳腺癌腫瘤細(xì)胞會(huì)表達(dá)過多的PD-L1，降低其免疫原性，導(dǎo)致機(jī)體無法產(chǎn)生充足的抗腫瘤免疫效應(yīng)，造成腫瘤細(xì)胞成功逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視，發(fā)生腫瘤免疫逃逸，而放療后腫瘤細(xì)胞被殺傷殺滅，PD-L1 表達(dá)便隨之下調(diào)［11］。故臨床可通過監(jiān)測(cè)放療期間PD-L1 變化情況及早預(yù)測(cè)放療效果。

HLA-B 是HLA-Ⅰ類分子中最主要的因子之一，廣泛分布于所有有核細(xì)胞表面，此類因子屬于機(jī)體免疫的核心，不僅可參與免疫應(yīng)答遺傳調(diào)控、調(diào)節(jié)全身免疫狀態(tài)，還是影響免疫識(shí)別的主要因素，在腫瘤發(fā)生時(shí)表達(dá)降低或缺失。Tevis SE 等［12］報(bào)道證實(shí)，乳腺間變性大細(xì)胞淋巴瘤患者HLA-B表達(dá)明顯減少，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。本研究則表明，與放療前相比，乳腺癌患者放療后PBMC中HLA-BmRNA 明顯升高，且其放療前后的變化差值與放療療效密切相關(guān)。究其原因，PBMC 是重要的抗原遞呈細(xì)胞，宿主PBMC中HLA-B 的表達(dá)不僅代表的是宿主的免疫特性，還可呈現(xiàn)腫瘤特性，是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵，其表達(dá)量下調(diào)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞逃逸的重要機(jī)制之一［13］。因此，臨床可根據(jù)PBMC中HLA-B 表達(dá)情況評(píng)估患者機(jī)體細(xì)胞免疫情況及腫瘤特性，為制定個(gè)體化放療方案提供可靠依據(jù)。

報(bào)道顯示，炎癥除了是腫瘤發(fā)生的影響因素之外，還可改變藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)及活性，促使腫瘤對(duì)放化療產(chǎn)生耐藥性，成為腫瘤放化療失敗的重要原因［14］。MPR5 是臨床常見的多藥耐藥相關(guān)蛋白之一，其表達(dá)上調(diào)可能是由于腫瘤患者外周血中的促炎介質(zhì)與PBMC 表面相應(yīng)受體結(jié)合的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，本研究結(jié)果顯示，PBMC中MPR5mRNA 放療后呈下降趨勢(shì)，其中放療無效組雖有下降但并不明顯，放療有效組下降較為顯著，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是放療雖可殺傷殺滅腫瘤細(xì)胞，但也會(huì)一定程度損傷正常細(xì)胞，破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致促炎因子釋放并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，激活NF-κB，釋放相關(guān)因子改變MRP5 活性功能與表達(dá)情況，并將輸入的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒從細(xì)胞中泵出，從而引發(fā)耐藥效應(yīng)［15］。提示監(jiān)測(cè)其在放療過程中的變化情況是及早預(yù)測(cè)放療療效的重要途徑。

此外，在上述研究基礎(chǔ)上，本研究初次嘗試探究放療前后PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA差值聯(lián)合預(yù)測(cè)放療療效的價(jià)值，結(jié)果顯示，三者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC 高達(dá)0.951，為臨床早期預(yù)測(cè)放療療效、調(diào)整放療方案提供新思路、新途徑，有利于提高療效，改善預(yù)后。但本研究屬于單中心、小樣本分析，可能造成數(shù)據(jù)偏移，需做進(jìn)一步分析與探究。

綜上可知，晚期乳腺癌放療過程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA 變化情況能作為臨床預(yù)測(cè)療效的潛在途徑，有助于及時(shí)調(diào)整放療方案、提高療效。