CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸診斷技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展

劉曉玫 魏雙施★ 于農(nóng)

作者單位：1.中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，中國(guó)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇，蘇州215163

2.蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇，蘇州215129

自1987年在大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）中發(fā)現(xiàn)規(guī)則成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）以來，對(duì)生物學(xué)，尤其是基因組編輯和基因工程領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用帶來了巨大的改變［1］。細(xì)菌和古細(xì)菌的原核細(xì)胞中存在的CRISPR/Cas 系統(tǒng)，通過依賴于指導(dǎo)RNA 的DNA 或RNA 核酸酶活性提供針對(duì)外來遺傳元件的適應(yīng)性免疫，保護(hù)生物體免受外源核酸的引入［2-4］。CRISPR 基因座由重復(fù)序列組成，長(zhǎng)度約為20～40 bp，被獨(dú)特的間隔20～58 bp 的間隔子隔開［5］。CRISPR 基因座的下游為編碼Cas 蛋白的序列，而且其中一些蛋白質(zhì)以前被認(rèn)為與DNA 修復(fù)有關(guān)［3］。病毒DNA 或質(zhì)粒首次進(jìn)入細(xì)胞后，它將被Cas 蛋白降解并插入重復(fù)序列之間的特定位點(diǎn)。如果細(xì)菌宿主確實(shí)具有CRISPR 系統(tǒng)，則這些序列會(huì)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄生成CRISPR RNA（crRNA），并與Cas 蛋白形成干擾復(fù)合物。在crRNA的指導(dǎo)下，該復(fù)合物可指導(dǎo)crRNA 與病毒DNA 之間氫鍵的形成，從而催化外源DNA的分裂［5］。

隨著研究的逐步深入，人們對(duì)CRISPR 和CRISPR 相關(guān)（Cas）蛋白的結(jié)構(gòu)以及功能有了更深的了解，發(fā)現(xiàn)具有核酸酶、解旋酶和聚合酶等多種活性的不同類型的Cas 蛋白。根據(jù)最新的分類，CRISPR/Cas 系統(tǒng)被分為兩個(gè)主要的大類、六種型以及48 個(gè)亞型。其中第一類的Cas 蛋白為多亞基效應(yīng)復(fù)合物，包括Ⅰ型的Cas3、Ⅲ型的Cas10、Ⅳ型的Csf1；第二類的Cas 蛋白為單亞基效應(yīng)蛋白，包括Ⅱ型的Cas9、Ⅴ型的Cas12 和Ⅵ型Cas13 等［6-7］。

CRISPR 系統(tǒng)因具有有效的核酸識(shí)別和編輯能力的固有優(yōu)勢(shì)，已被證明是核酸檢測(cè)的有力工具。此篇綜述簡(jiǎn)要總結(jié)CRISPR/Cas 系統(tǒng)在檢測(cè)中的幾種常用酶，及其在傳染病病原及腫瘤核酸診斷中的應(yīng)用進(jìn)展，旨在為該領(lǐng)域研究人員提供參考。

1 核酸檢測(cè)中的Cas 蛋白

1.1 Cas9

CRISPR/Cas9 的工作原理是，Cas9 與引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）協(xié)同工作。gRNA 包含一個(gè)CRISPR RNA（crRNA），其3′端與tracrRNA 配對(duì)，crRNA 的5′游離端是DNA 的靶序列，Cas9 抓住tracrRNA，形成二元復(fù)合體。這使Cas9 可以將crRNA 靶序列引導(dǎo)至DNA 分子上的互補(bǔ)區(qū)（前間隔序列）。crRNA 與前間隔序列的配對(duì)將使匹配的第二條DNA 鏈分開，并形成Cas9-gRNA-前間隔序列三元復(fù)合物。取決于前間隔序列和前間隔序列相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）的存在，crRNA 目標(biāo)序列可指導(dǎo)Cas9 切割前間隔序列中兩條DNA 鏈（圖1A）。為了方便進(jìn)行基因組編輯，crRNA 和tracrRNA 被設(shè)計(jì)為單個(gè)嵌合體，稱為單向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）［8-9］。2016年，Keith Pardee 等［10］首次報(bào)道了一種基于CRISPR/Cas9的序列特異性核酸酶活性的新技術(shù)，應(yīng)用于寨卡病毒檢測(cè)。作者利用依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（Nuclear Acid Sequence Based Amplification，NASBA），擴(kuò)增過程的中間產(chǎn)物雙鏈DNA 作為Cas9 核酸內(nèi)切酶的底物，如果Cas9 切割了該dsDNA 中間體，則體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生截短的RNA；而非目標(biāo)分子中間體不被切割產(chǎn)生完整的RNA，從而激活Toehold 反應(yīng)。靶標(biāo)RNA 的檢測(cè)通過紙盤上的顏色變化來指示（圖2A）。該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)區(qū)分具有單堿基差異的寨卡病毒毒株，例如非洲和美國(guó)Zika 變體，而區(qū)分不同的Zika變體可用于基因分型和確定感染的起源。

隨后，研究人員相繼開發(fā)了CRISPR/Cas9 與指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（Exponential amplification reaction，EXPAR）和滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）相結(jié)合的高度敏感和特異性的核酸檢測(cè)器。Huang及其同事將CRISPR/Cas9 切割與EXPAR 結(jié)合在一起，提出了一種稱為CAS-EXPAR 的單鏈核酸生物傳感方法［11］。在PAM 呈遞寡核苷酸（PAM-presenting oligonucleotide，PAMmer）的協(xié)助下，將ssDNA 或RNA 在特定位點(diǎn)切割，以釋放短片段，這些片段起引物作用以啟動(dòng)EXPAR 過程，從而產(chǎn)生豐富的ds-和ssDNA 擴(kuò)增子。EXPAR強(qiáng)大的指數(shù)擴(kuò)增能力使CAS-EXPAR 的分析靈敏度達(dá)到了0.82 aM。就特異性而言，CAS-EXPAR可以區(qū)分恰好位于切割位點(diǎn)的單堿基錯(cuò)配，因?yàn)樵撳e(cuò)配會(huì)阻礙EXPAR 的引物延伸，從而消除讀數(shù)。CAS-EXPAR 技術(shù)已成功應(yīng)用于單核細(xì)胞增生李斯特菌mRNA 的檢測(cè)。

1.2 Cas13

Cas13 是一種RNA 引導(dǎo)的核糖核酸酶（RNase）。Cas13a 在相應(yīng)的crRNA 的引導(dǎo)下，特異性切割帶有互補(bǔ)間隔序列的單鏈RNA（ssRNA）。而且，結(jié)合到ssRNA 靶標(biāo)后，Cas13a 蛋白被激活并轉(zhuǎn)化為非特異性內(nèi)切酶，對(duì)附近的非靶標(biāo)ssRNA具有附帶的裂解活性（圖1C）［12-13］。2016年，East-Seletsky及其同事首次嘗試使用LbuCas13a 檢測(cè)噬菌體λRNA 和內(nèi)源性β-肌動(dòng)蛋白mRNA。Cas13a被ssRNA 靶標(biāo)激活，進(jìn)而降解了熒光淬滅劑標(biāo)記的ssRNA（ssRNA-FQ）報(bào)告基因，從而增加了熒光強(qiáng)度，并實(shí)現(xiàn)了檢出限（Limit of detection，LOD）低至1-10 pM 的快速檢測(cè)［12］。

2017年，張鋒等［14］報(bào)道了基于Cas13a 的“SHERLOCK”核酸診斷工具。首先，將重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）或RT-RPA 用作預(yù)擴(kuò)增，然后進(jìn)行T7 體外轉(zhuǎn)錄，這會(huì)產(chǎn)生大量RNA 擴(kuò)增子，這些擴(kuò)增子隨后觸發(fā)ssRNA-FQ 報(bào)告基因的Cas13 側(cè)鏈切割，從而產(chǎn)生熒光讀數(shù)（圖2B）。整個(gè)過程在37℃條件下的1～3 h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了阿摩爾（attomolar，aM 或10-18M）濃度的RNA 和DNA 檢測(cè)。值得關(guān)注的是，將該技術(shù)試劑制成凍干濾紙可用于即時(shí)檢測(cè)（point-ofcare testing，POCT），同時(shí)保持了阿摩爾的靈敏性，而且成本低廉，只需0.61 美元/反應(yīng)。隨后，該團(tuán)隊(duì)推出了名為SHERLOCKv2 的二代技術(shù)，它增加了四點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：①可實(shí)現(xiàn)單管四重檢測(cè)；②通過調(diào)節(jié)RPA 引物來控制指數(shù)預(yù)擴(kuò)增的進(jìn)程，從而在低至阿摩爾水平的各種濃度范圍內(nèi)進(jìn)行定量；③由Cas13a 側(cè)鏈切割觸發(fā)的Csm6 核酸酶活性的級(jí)聯(lián)激活提高敏感性；④90 分鐘內(nèi)通過肉眼讀數(shù)靈敏度可達(dá)2 aM?？偟膩碚f，SHERLOCK 和先進(jìn)的SHERLOCKv2 是具有aM 級(jí)的核酸檢測(cè)靈敏度和單堿基特異性的多功能、快速、便攜式且經(jīng)濟(jì)高效的核酸檢測(cè)技術(shù)，這對(duì)于POCT、流行病監(jiān)測(cè)和病原體檢測(cè)非常需要，尤其適用于基礎(chǔ)設(shè)施比較不完善的欠發(fā)達(dá)地區(qū)。

1.3 Cas12

2 類V-A 型的Cas12a 系統(tǒng)（以前稱為Cpf1），是由有序的cas12a-cas4-cas1-cas2-CRISPR 陣列組成。Cas12a蛋白含有RuvC 內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域，可識(shí)別富含T 的PAM 序列以進(jìn)行靶標(biāo)切割［15］。此外，Cas12，特別是LbCas12a，與其目標(biāo)DNA 的結(jié)合釋放了非特異性的ssDNA 切割活性（圖1B）。DETECTR技術(shù)（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）和HOLMES 技術(shù)（one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System）正是基于Cas12的這種靶向激活的附帶ssDNA 切割活性而開發(fā)的［15］。其工作原理是通過RPA 或RT-RPA 等溫?cái)U(kuò)增靶核酸，然后結(jié)合Cas12a-sgRNA 復(fù)合物并觸發(fā)ssDNA熒光猝滅劑報(bào)告ssDNA 的裂解，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。見圖2C。

圖2 基于CRISPR/Cas 的核酸檢測(cè)工具［23］Figure 2 Nucleic acid detection tool based on CRISPR/Cas

1.4 Cas14

Cas14 是一種很小的Cas 蛋白，大小僅為其他Cas 蛋白的一半。Cas14 蛋白能夠進(jìn)行靶向單鏈DNA（ssDNA）切割，而無需PAM 進(jìn)行激活（圖1D）。此外，Cas14 識(shí)別靶標(biāo)會(huì)觸發(fā)非特異性ssDNA分子裂解活性，類似于含RuvC 的酶Cas12a［18］。Cas14a 也可應(yīng)用到DETECTR 平臺(tái)中，以生成一個(gè)新的ssDNA 檢測(cè)系統(tǒng)Cas14a-DETECTR。它可以在沒有PAM 限制的情況下進(jìn)行高保真DNA 單核苷酸多態(tài)性（SNP）以及病毒DNA 檢測(cè)［19］。

圖1 CRISPR/Cas 核酸識(shí)別示意圖［16-17］Figure 1 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid recognition

2 CRISPR/Cas 核酸檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用

2.1 病原檢測(cè)

2.1.1 人乳頭瘤病毒檢測(cè)

人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一種Papillomaviridae 家族的DNA 病毒，可引起某些常見的人類癌癥，尤其是宮頸癌，而宮頸癌是全世界女性第二大最常見的癌癥死亡原因。準(zhǔn)確地鑒定HPV 基因型對(duì)于確定那些處于HPV 相關(guān)癌癥風(fēng)險(xiǎn)中的人至關(guān)重要。最近報(bào)道了三種CRISPR-分型PCR（CRISPR-typing PCR，ctPCR）的方法。其原理是通過一對(duì)Cas9-sgRNA 復(fù)合物切割靶DNA，然后將切割的DNA 連接形成線性或環(huán)狀分子，再通過PCR 或qPCR 擴(kuò)增檢測(cè)［20-22］。除Cas9 系統(tǒng)外，前文也提到了基于“附帶”裂解活性的Cas12a 的DETECTR 檢測(cè)平臺(tái)也可用于HPV 檢測(cè)［15］。

2.1.2 SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2）檢測(cè)

當(dāng)前由SARS-CoV-2 引起了（新冠肺炎）（COVID-19）全球大流行。建立快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的SARS-CoV-2 診斷對(duì)于疾病的早期治療和控制至關(guān)重要。研究者們基于CRISPR 的診斷原理，利用Cas12、Cas13 識(shí)別切割特性開發(fā)出一系列快速、精準(zhǔn)的方法來檢測(cè)SARS-CoV-2。此外，Moon 等［24］報(bào)道了一種基于CRISPR/dCas9 系統(tǒng)的病毒診斷方法，并成功檢測(cè)出SARS-CoV-2、pH1N1 和pH1N1/H275Y 突變病毒。

2.1.3 結(jié)核分枝桿菌（Mtb）檢測(cè)

結(jié)核病主要由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染引起的傳染病，是一項(xiàng)嚴(yán)重的全球健康挑戰(zhàn)，預(yù)防和控制結(jié)核病的關(guān)鍵是開發(fā)低成本、快速且可靠的診斷方法，尤其在資源匱乏的地區(qū)及早診斷結(jié)核?。?5］。Zhang 等［26］將dCas9分別連接到一對(duì)螢火蟲熒光素酶（NFluc 和CFluc）的N 端和C 端，在sgRNA 的指導(dǎo)下，分別與靶DNA序列的上游和下游片段互補(bǔ)。當(dāng)兩個(gè)相鄰片段的底物DNA 被一對(duì)dCas9 結(jié)合時(shí)，熒光素酶的整體催化活性就會(huì)產(chǎn)生熒光。國(guó)內(nèi)的張文宏團(tuán)隊(duì)建立了一種基于Cas12a 的Mtb 快速精準(zhǔn)檢測(cè)系統(tǒng)［27］。

2.2 癌癥診斷

監(jiān)測(cè)腫瘤來源的細(xì)胞外囊泡（Tumor-derived EVs，TEVs）并檢測(cè)其內(nèi)含的生物標(biāo)志物，可能是在“液體活檢”中篩查癌癥的一種有前途的方法。Li 等通過將特異性結(jié)合TEV 上蛋白質(zhì)靶標(biāo)的適配體，與基于PCR 的指數(shù)擴(kuò)增和CRISPR/Cas12a 實(shí)時(shí)DNA 檢測(cè)相結(jié)合，開發(fā)了一種稱為aptamer-CRISPR/Cas12a 檢測(cè)的新技術(shù)，可快速、方便地檢測(cè)血清中超低濃度的CD109+和EGFR+TEV，可用于鼻咽癌的診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)［28］。

MicroRNA（miRNA）作為癌癥早期臨床診斷的潛在生物標(biāo)記已被廣泛地研究［29］。Zhou 等［30］構(gòu)建了一個(gè)由CRISPR/Cas13a 驅(qū)動(dòng)的便攜式電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）芯片（PECL-CRISPR）。其中靶標(biāo)miRNA 激活Cas13a 以裂解系統(tǒng)中設(shè)計(jì)的預(yù)引物，并觸發(fā)隨后的指數(shù)擴(kuò)增和ECL 檢測(cè)，miR-17 的檢測(cè)限達(dá)到1×10-15M。

3 小結(jié)與展望

基于CRISPR 的核酸檢測(cè)系統(tǒng)經(jīng)過幾年的發(fā)展，已經(jīng)顯示出其巨大的優(yōu)勢(shì)，比如可以提供快速、靈敏、特異性、低成本以及現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)定量分析，并且可以實(shí)現(xiàn)多重化檢測(cè)。該技術(shù)已被用于醫(yī)學(xué)診斷的多個(gè)領(lǐng)域，例如，它們可以用于確定病原體的基因型，從而實(shí)現(xiàn)量身定制的治療。它們還可以用于檢測(cè)人、動(dòng)物、植物或環(huán)境病原體。此外，還可用于植物病原體的鑒定和基因型檢測(cè)以指導(dǎo)農(nóng)藥施用的數(shù)量和類型；關(guān)鍵病原體的檢測(cè)來快速評(píng)估水質(zhì)或評(píng)估生物恐怖威脅；食品中的病原體檢測(cè)以預(yù)防食源性疾病等。隨著當(dāng)前技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展以及新型功能強(qiáng)大的Cas 直系同源物的不斷開發(fā)，相信CRISPR/Cas 系統(tǒng)將成為核酸檢測(cè)不可替代的重要工具。