黏菌素細菌藥物敏感性檢測方法學評價

黃 麗， 胡付品， 朱德妹， 郭 燕， 鄭永貴 ， 楊 洋， 韓仁如， 張 宏， 黃德喜

黏菌素是陽離子多肽類殺菌劑，主要與細胞外膜上的脂多糖結(jié)合，從而破壞細菌的脂多糖結(jié)構(gòu)導致細菌死亡[1]。由于黏菌素存在腎毒性和神經(jīng)毒性，一度被臨床停用。但近年來多重耐藥甚至全耐藥革蘭陰性桿菌的流行播散，為臨床的抗感染治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。多黏菌素類抗菌藥物作為治療耐藥革蘭陰性桿菌所致感染的有效藥物之一，老藥新用以挽救耐藥革蘭陰性桿菌感染患者的生命。

由于多黏菌素類藥物分子量較大，在瓊脂中不易擴散，導致擴散方法的準確性較差[2]。2016年歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會/美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（EUCAST/CLSI）發(fā)表聯(lián)合聲明，不建議采用瓊脂稀釋法、紙片擴散法和梯度擴散法進行多黏菌素藥物敏感性試驗[3]。CLSI和EUCAST建議肉湯微量稀釋法（BMD）是唯一有效的測試方法[4]，但這種方法操作復雜，成本較高，在大多數(shù)臨床實驗室很難常規(guī)開展。2020年CLSI推薦黏菌素肉湯紙片洗脫法（CBDE）和黏菌素瓊脂試驗（CAT）可作為檢測腸桿菌目細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌復合菌群對黏菌素的敏感性試驗[5]。為了解這兩種方法與標準BMD的一致性，本研究對臨床分離的486株非重復菌株進行方法學比較，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌收集 2019年1月—2020年6月安徽省銅陵市立醫(yī)院臨床分離的非重復菌株486株，包括腸桿菌目細菌277株、銅綠假單胞菌105株和鮑曼不動桿菌104株；腸桿菌目細菌中大腸埃希菌104株、肺炎克雷伯菌125株和其他腸桿菌目細菌48株。藥敏試驗質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922和大腸埃希菌mcr-1陽性株（黏菌素MIC=4 mg/L）[6]。

1.1.2 培養(yǎng)基和抗菌藥物 CAMHB肉湯為BD公司產(chǎn)品，黏菌素（colistin）標準品（批號130327-200906， 效價22 740 U/mg）為中國食品藥品生物檢定所產(chǎn)品，黏菌素紙片（10 μg/片）為OXOID公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 BMD測試 按照CLSI M23[7]、M07[8]中規(guī)定配制操作。

1.2.2 CBDE[5]和CAT[5]根據(jù)CLSI M100-S30 文件推薦操作進行。

1.2.3mcr-1基因檢測 參照相關文獻[9]采用煮沸法提取細菌DNA模板，PCR方法檢測mcr-1基因，所用引物按參考文獻[10]方法合成。

1.3 評判標準

使用所比較方法的最小范圍，將黏菌素MIC結(jié)果截短至相同的濃度范圍進行方法比較[11]。評估方法學指標[7]為基本一致率（EA）（MIC相差±1稀釋度）、分類一致率（CA）、重大誤差（ME）和非常重大誤差（VME）。如果EA≥90%、CA≥90%，ME≤3%，VME≤1.5%，則認為結(jié)果可以接受。

2 結(jié)果

2.1 細菌對黏菌素的敏感性

486株細菌藥敏試驗結(jié)果顯示，黏菌素對腸桿菌目細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌具有高度抗菌活性，細菌耐藥率分別為6.5%～6.9%、3.8%和1.0%～1.9%。見表1。486株臨床分離株經(jīng)3種方法測定，結(jié)果示黏菌素對23株細菌的MIC值均＞4 mg/L，其中陰溝腸桿菌8株、肺炎克雷伯菌5株、大腸埃希菌4株、銅綠假單胞菌4株、產(chǎn)氣克雷伯菌1株和鮑曼不動桿菌1株，按CLSI相關黏菌素耐藥（R）的折點標準≥4 mg/L均可判斷為對黏菌素耐藥。PCR檢測質(zhì)粒介導黏菌素耐藥基因mcr-1結(jié)果顯示，所有耐藥細菌均為陰性（數(shù)據(jù)未羅列）。

表1 三種方法測定細菌對黏菌素的敏感性Table1 Susceptibility of clinical isolates to colistin determined by three methods

2.2 CBDE測定細菌對黏菌素的敏感性

采用CBDE檢測486株細菌對黏菌素的耐藥性，共檢出25株細菌MIC值≥4 mg/L，包括19株腸桿菌目細菌、4株銅綠假單胞菌和2株鮑曼不動桿菌。經(jīng)BMD測定MIC=1 mg/L的1株肺炎克雷伯菌和1株MIC=0.5 mg/L鮑曼不動桿菌，CBDE檢測的MIC值均≥4 mg/L，重復檢測后2株細菌結(jié)果均無改變。見圖1。

圖1 黏菌素肉湯紙片洗脫法Figure 1 Colistin broth disk elution method

2.3 CAT測定細菌對黏菌素的敏感性

采用CAT方法檢測486株細菌對黏菌素耐藥性，共檢出24株細菌MIC值≥4 mg/L，包括19株腸桿菌目細菌、4株銅綠假單胞菌和1株鮑曼不動桿菌。與上述CBDE相同的1株肺炎克雷伯菌，BMD測定為MIC=1 mg/L，CAT檢測為4 mg/L，重復檢測后MIC值沒有改變。見圖2。

圖2 黏菌素瓊脂試驗Figure 2 Colistin agar test method

2.4 三種方法檢測結(jié)果一致性比較

2.4.1 CBDE與BMD比較 與BMD結(jié)果相比，CBDE測定腸桿菌目細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對黏菌素的敏感性，EA分別為90.3%、96.2%和87.5%；CA分 別 為99.6%、100%和99.0%；ME分別為0.4%、0和1.0%；VME均為0。共有13株鮑曼不動桿菌BMD 的MIC值與CBDE的MIC值相差大于±1稀釋度。見圖3和表2。

圖3 CBDE和BMD測定腸桿菌目細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對黏菌素敏感性的散點圖Figure 3 Scatter plot for determining the sensitivity of Enterobacterales, P. aeruginosa and A. baumannii to colistin by CBDE and BMD

2.4.2 CAT與BMD比較 與BMD結(jié)果相比，CAT測定腸桿菌目細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對黏菌素的敏感性，EA分別為96.8%、93.3%和99.0%；腸桿菌目細菌CA為99.6%、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌CA均為100%；腸桿菌目細菌ME為0.4%、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌ME均為0；VME均為0。見表2和圖4。

表2 CBDE、CAT與BMD檢測黏菌素敏感性結(jié)果一致性比較Table 2 Consistency of the results of colistin susceptibility tested by CBDE and CAT with reference to BMD

圖4 CAT和BMD測定腸桿菌目細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對黏菌素敏感性的散點圖Figure 4 Scatter plot for determining the sensitivity of Enterobacterales, P. aeruginosa and A. baumannii to colistin by CAT and BMD

表2顯示與BMD比較，CBDE和CAT檢測腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌對黏菌素敏感性的EA和CA均＞90%，ME均＜3%，VME均為0，具有較高的一致性；而對于鮑曼不動桿菌，CBDE與BMD比較，EA為87.5%，低于90%的可接受率，因此還需要更多的臨床數(shù)據(jù)進一步驗證探究。

3 討論

隨著碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，缺乏安全有效的藥物治療和相關感染導致的高死亡率是威脅全球公共衛(wèi)生的關鍵因素[12-14]。碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌的高耐藥率促使了多黏菌素重新啟用，因有著突出且不可替代的作用，多黏菌素成為治療此類耐藥菌株的最后一道防線[15]。2019年CHINET顯示[16]，腸桿菌目細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對黏菌素具有高度敏感率，耐藥率僅為4.3%、1.1%和0.5%。由于多黏菌素存在腎毒性和中樞神經(jīng)毒性、極窄的治療指數(shù)以及藥動學/藥效學等問題導致臨床該類藥物使用受限[17]，因此提供準確的藥敏試驗結(jié)果對于臨床抗感染治療有重要價值。

盡管多黏菌素在臨床使用了這么長的時間，但有效性測試的最佳方法仍然不確定。BMD是藥敏試驗金標準方法，是由CLSI和EUCAST推薦的唯一方法[4]。然而，在臨床微生物實驗室BMD法作為常規(guī)開展檢測臨床分離株的藥敏試驗相比較紙片法、商品化藥敏測定儀等，則較為繁瑣復雜。多黏菌素在瓊脂中擴散緩慢，抑制區(qū)域小，與參考方法相比，錯誤敏感率可高達35%[18]。也有文獻報道E試驗檢測方法低估了多黏菌素耐藥菌株的耐藥水平（MIC≥4 mg/L），高估了易感菌株的MIC值（MIC＜4 mg/L）[19]。因此基于瓊脂擴散的紙片擴散法、E試驗法因較低的靈敏度，不適用于多黏菌素抗菌活性的測定[20-22]。儀器方法操作簡單，藥敏測試的時間縮短，但是在VITEK 2系統(tǒng)檢測黏菌素耐藥革蘭陰性菌時靈敏度較低[21]，而Phoenix自動化微生物系統(tǒng)，則發(fā)現(xiàn)了較高的假敏感性結(jié)果（15%）[17]。

為了尋找一種與BMD同樣精確、操作簡單且更適合臨床實驗室開展的黏菌素藥敏試驗，CLSI經(jīng)過多中心評估[23]，認定CBDE和CAT檢測黏菌素抗菌活性與BMD具有高度一致性，因此2020年1月CLSI推薦這兩種方法作為檢測腸桿菌目細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌復合菌群黏菌素敏感性的試驗[5]。

本研究中，我們對277株腸桿菌目細菌、105株銅綠假單胞菌和104株鮑曼不動桿菌進行了CBDE和CAT的檢測。以BMD為參考方法，進行方法學比較，以期獲得較好的一致性結(jié)果。檢測結(jié)果顯示，與BMD檢測得的MIC值比較，CBDE測定腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌對黏菌素敏感性的EA和CA均＞90%，ME均＜3%，VME均為0，與BMD具有較高的一致性，驗證了CLSI的推薦。對于鮑曼不動桿菌，CBDE與BMD比較，EA為87.5%，低于90%的可接受率，這與CLSI的推薦不符，因此還需要更多的臨床數(shù)據(jù)進一步驗證探究。與BMD獲得的MIC值比較，CAT測定黏菌素對腸桿菌目細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌抗菌活性的EA和CA均＞90%，ME均＜3%，VME均為0，與BMD具有較高的一致性，也驗證了CLSI的推薦。臨床微生物實驗室可根據(jù)需要選擇CBDE或CAT對黏菌素的耐藥菌株常規(guī)篩查。

質(zhì)粒攜帶的mcr基因及亞型是導致細菌對多黏菌素耐藥的重要機制 ，全球已經(jīng)報道的有8種不同質(zhì)粒攜帶的基因型mcr-1～mcr-8[24]。本研究中，對檢出的23株黏菌素耐藥株（腸桿菌目細菌18株、銅綠假單胞菌4株和鮑曼不動桿菌1株），僅選擇了耐藥基因mcr-1的分子生物學檢測，其結(jié)果均為陰性。提示耐藥菌株可能存在其他還未認識的mcr基因型或還存在目前未能發(fā)現(xiàn)的耐藥機制[25]，值得進一步的深入研究。

總之，作為向臨床推廣的兩種黏菌素MIC檢測的方法，CBDE和CAT都是操作相對簡單且價格低廉的方法。CBDE可以購買成品的CAMHB肉湯管，省去試驗過程中很多繁瑣的步驟。CAT在應用中類似于篩選培養(yǎng)基，但因含有不同藥物濃度的黏菌素不能長時間保存。期待有更加簡便、實用的藥敏試驗方法，便于實驗室準確檢測黏菌素對臨床菌株的MIC值，更好服務于臨床。