高毒力肺炎克雷伯菌中KPC-2型碳青霉烯酶對(duì)細(xì)菌毒力的影響

?？∮ⅲ?魏 清， 沈 震， 袁 挺， 李 敏

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）被WHO列為“緊急威脅” 人類健康的病原菌，可引起嚴(yán)重的肺炎、血流感染及肝膿腫等[1]。目前對(duì)臨床威脅最大的主要是碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）和高毒力/高黏液肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae， hvKP）[2-3]。CRKP主要引起醫(yī)院獲得性感染，毒力低但耐藥率高，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，臨床常見的碳青霉烯酶主要有 KPC-2、NDM-1及 OXA-48[4]。相較于 CRKP，hvKP多表現(xiàn)為高黏液表型，耐藥率低但毒性較強(qiáng)，主要引起社區(qū)獲得性肝膿腫，且極易引發(fā)眼內(nèi)炎和腦膜炎等侵襲綜合征，致死率及致殘率較高[5]。隨著細(xì)菌耐藥及毒力的傳播擴(kuò)散，毒力高且對(duì)碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌不斷出現(xiàn)。2016年Zhang等[6]首次報(bào)道了浙江地區(qū)由K1型ST1797碳青霉烯類耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenemresistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CR-hvKP）引起的醫(yī)院感染，引發(fā)了極大的關(guān)注。

本研究通過體外過表達(dá)blaKPC-2并轉(zhuǎn)化hvKP的方法構(gòu)建碳青霉烯類耐藥的hvKP株，即CR-hvKP，比較hvKP耐藥前后細(xì)菌毒力變化， 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源

收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院2018年1—12月臨床標(biāo)本中分離的3株碳青霉烯類敏感的高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitive hypervirulentKlebsiella pneumoniae， CS-hvKP） 作為實(shí)驗(yàn)菌株。體外藥物敏感性試驗(yàn)采用肉湯微量稀釋法。參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）方法進(jìn)行[7]。

1.2 高黏液表型（HM）檢測(cè)、莢膜血清分型及毒力基因檢測(cè)

1.2.1 拉絲試驗(yàn) 采用黏液拉絲試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌高黏液表型，用接種環(huán)輕觸血瓊脂平皿上過夜培養(yǎng)的新鮮菌落向外牽拉，重復(fù)牽拉2次，若2次均有黏液絲形成并且長(zhǎng)度大于5 mm即判為HM表型陽(yáng)性[8]。

1.2.2 毒力基因PCR檢測(cè) 采用PCR方法擴(kuò)增檢測(cè)10種毒力基因及6種常見莢膜血清分型，毒力基因包括（rmpA、rmpA2、iroB、iutA、ybtS、entB、allS、mrkD、magA、kfu），血清型包括K1、K2、K5、K54、K57 及K20。PCR擴(kuò)增引物及條件參照文獻(xiàn)[9-10]。

1.3 細(xì)菌分子流行病學(xué)檢測(cè)

采用多位點(diǎn)序列分型（MLST）對(duì)hvKP進(jìn)行同源性分析。PCR擴(kuò)增細(xì)菌7個(gè)管家基因片段（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB）后測(cè)序，結(jié) 果 與 網(wǎng) 站（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html）進(jìn)行比對(duì)。

1.4 轉(zhuǎn)化株CR-hvKP（blaKPC-2）構(gòu)建

1.4.1 pHSG396-KPC重組質(zhì)粒的構(gòu)建 自行設(shè)計(jì)blaKPC-2基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增引物，5’處添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，引物信息見表1。選取臨床上分離的經(jīng)PCR擴(kuò)增并測(cè)序分析后確定為blaKPC-2陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌，采用煮沸法制備模板，擴(kuò)增blaKPC-2，將PCR產(chǎn)物酶切后連接至pHSG396載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含50 mg/L氯霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子增菌培養(yǎng)后，抽提重組質(zhì)粒，核酸定量后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 pHSG396-KPC重組質(zhì)粒構(gòu)建的擴(kuò)增引物Table 1 Amplification primer for construction of pHSG396-KPC recombinant plasmid

1.4.2 pHSG396-KPC重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 將3株臨床分離的hvKP增菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將pHSG396-KPC重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至敲除株中，在含50 mg/L氯霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，鑒定轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌為CR-hvKP，即blaKPC-2轉(zhuǎn)化株。

1.5 血清抵抗試驗(yàn)體外檢測(cè)細(xì)菌毒力

采用血清抵抗試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌對(duì)血清中補(bǔ)體等殺菌物質(zhì)的抵抗能力，方法參考文獻(xiàn)[11]。將待測(cè)菌株增菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并調(diào)整菌液濃度為1×106CFU/mL，將上述菌液分別與健康成年人的混合血清按照體積比1∶3混合在一起，37℃孵育，對(duì)孵育0 h、1 h、2 h和3 h后混合物進(jìn)行活菌數(shù)計(jì)數(shù)（viable counts， VC）。計(jì)算存活率（survival rate， SV），即 1 h/0 h、2 h/0 h、3 h/0 h 相應(yīng)表示為SV1h、SV2h及SV3h。按照參考文獻(xiàn)[12]根據(jù)細(xì)菌存活率變化劃分為6個(gè)等級(jí)（1級(jí)：SV1h＜10%，SV2h＜10%，SV3h＜0.1%；2級(jí)：SV1h10%～100%， SV3h＜10% ；3 級(jí) ： SV1h＞100%，SV2h＜100%，SV3h＜100% ；4 級(jí) ：SV1h＞100%，SV2h＞100%， SV3h＜100% ；5 級(jí) ：SV1h＞100%，SV2h＞100%，SV3h＞100%在第三階段菌落數(shù)有所下降 ；6 級(jí) ：SV1h＞100%， SV2h＞100%， SV3h＞100%在3個(gè)階段菌落數(shù)一直上升），1級(jí)和2級(jí)為對(duì)血清中殺菌物質(zhì)敏感，3級(jí)和4級(jí)為中介，5級(jí)和6級(jí)為耐藥。

1.6 結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜形成能力

生物膜測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]，將待測(cè)菌液濃度調(diào)整為1×107CFU/mL，取150 μL待測(cè)菌株加入96孔平底板，同時(shí)做3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育16～24 h后用0.5%的結(jié)晶紫染色20 min， 蒸餾水將未結(jié)合染料沖洗干凈，結(jié)合染料用95%乙醇溶解后檢測(cè)600 nm處吸光度（D）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。將生物膜形成能力按照D600測(cè)定值作以下分類：強(qiáng)生物膜形成能力（D600＞0.5），中等生物膜形成能力（0.2≤D600≤0.5），弱生物膜形成能力（D600＜0.2）。

1.7 細(xì)菌黏液性檢測(cè)及莢膜多糖測(cè)定

1.7.1 低速度離心法檢測(cè)細(xì)菌黏液性 細(xì)菌黏液性測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]，將培養(yǎng)6 h的菌液濃度調(diào)整至D600為1.0，低速度（1 000×g）離心5 min，測(cè)定上清液D600。與低黏液性菌株相比，高黏液性菌株沉淀不堅(jiān)實(shí)，且上清液較為渾濁，D600較高。

1.7.2 苯酚-硫酸法檢測(cè)細(xì)菌莢膜多糖含量 細(xì)菌莢膜多糖提取及測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]。500 μL過夜菌與100 μL含有1% zwittergent 3-14的檸檬酸（pH 2.0）混合，50℃孵育過夜，離心取上清液250 μL，加入無水乙醇，4℃沉淀莢膜多糖，30 min后離心去掉上清液，沉淀在管底的莢膜多糖晾干后用100 μL蒸餾水溶解。提取好的莢膜多糖與一定濃度范圍（0、50、100、150、200 mg/L）的糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品均進(jìn)行以下測(cè)定，加入600 μL硫酸（含12.5 mmol/L硼酸），煮沸5 min后，加入3-氨基苯酚至體積比為0.15%，測(cè)定D520，莢膜多糖含量經(jīng)糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。同時(shí)，對(duì)500 μL過夜菌進(jìn)行稀釋計(jì)數(shù)，最終，莢膜多糖含量經(jīng)換算單位表示為μg/109CFU。

1.8 熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)莢膜多糖結(jié)構(gòu)基因及調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平

提取hvKP野生株及blaKPC-2轉(zhuǎn)化株的mRNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR檢測(cè)hvKP野生株及blaKPC-2轉(zhuǎn)化株莢膜多糖結(jié)構(gòu)基因orf1-2（galF）、orf3-15（wzi）、orf16-17（manC）及調(diào)控基因rmpA、rmpA2轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異。hvKP野生株為對(duì)照菌株，23S rRNA 為內(nèi)參基因，以rmpA基因?yàn)槔?，如下所示?/p>

ΔCT= CT（rmpA基因）－CT（23S rRNA基因）

-ΔCt=ΔCT（hvKP野 生 株 ）－ΔCT（blaKPC-2轉(zhuǎn)化株）

2-ΔΔCT即為rmpA基因的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 hvKP野生株莢膜血清型、毒力基因分布及臨床資料

3株hvKP野生株均為HM陽(yáng)性。其中1株（K1843）為ST23 K1型，來源于急診內(nèi)科，標(biāo)本類型為靜脈血，所檢測(cè)的10種毒力基因均為陽(yáng)性。2株為ST65 K2型，來源于住院患者，標(biāo)本類型分別為痰液（K1953）及肝穿刺液（K1722），2株hvKP 中rmpA、rmpA2、iroB、iutA、ybtS、entB、mrkD均為陽(yáng)性，magA、allS及kfu均為陰性。見表2和表3。

表2 3株hvKP臨床資料及分子分型特征Table 2 Clinical data and molecular typing of the 3 hypervirulent Klebsiella pneumoniae strains

表3 3株hvKP藥敏結(jié)果及毒力基因攜帶情況Table 3 Antimicrobial susceptibility and prevalence of virulence genes among the 3 hvKP isolates

2.2 blaKPC-2轉(zhuǎn)化株的特性

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，hvKP野生株中blaKPC-2為陰性，而過表達(dá)株中blaKPC-2為陽(yáng)性，即為過表達(dá)及轉(zhuǎn)化成功，此外，藥敏試驗(yàn)也顯示，hvKP野生株對(duì)亞胺培南和美羅培南敏感，而blaKPC-2轉(zhuǎn)化株對(duì)這兩種藥物轉(zhuǎn)為耐藥，該結(jié)果也可證實(shí)過表達(dá)及轉(zhuǎn)化成功。

圖1 hvKP野生株與blaKPC-2轉(zhuǎn)化株瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖Figure 1 Identification of wild-type hypervirulent Klebsiella pneumoniae and blaKPC-2 transformants by agarose gel electrophoresis

血清抵抗試驗(yàn)顯示，K1843野生株在1 h、2 h及3 h生存率均超過100%，但在3 h時(shí)細(xì)菌存活率有所下降，按照判定規(guī)則可判定為5級(jí)，對(duì)血清中殺菌物質(zhì)耐受。同樣地，K1953和K1722均可判定為3級(jí)，對(duì)血清中殺菌物質(zhì)中介。而blaKPC-2轉(zhuǎn)化株均可判定為1級(jí)，對(duì)血清中殺菌物質(zhì)敏感。見圖2。

圖2 hvKP野生株與blaKPC-2 轉(zhuǎn)化株血清抵抗試驗(yàn)結(jié)果Figure 2 Serum assay of hvKP wild-type and blaKPC-2 transformants

生物膜測(cè)定結(jié)果顯示，K1722野生株與blaKPC-2轉(zhuǎn)化株生物膜形成能力沒有差異。與K1953和K1843野生株相比，相應(yīng)的blaKPC-2轉(zhuǎn)化株生物膜形成能力明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 hvKP野生株與blaKPC-2 轉(zhuǎn)化株生物膜實(shí)驗(yàn)Figure 3 Biofilm assay of hvKP wild-type and blaKPC-2 transformants

2.3 細(xì)菌黏液性及莢膜多糖含量檢測(cè)

與3株hvKP野生株相比，blaKPC-2過表達(dá)株經(jīng)低速度離心后，底部沉淀形成堅(jiān)實(shí)，上清液較為清澈，黏液性明顯降低，且莢膜多糖含量明顯下降。見圖4A。

采用苯酚-硫酸法測(cè)定莢膜多糖含量并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)現(xiàn)，3株hvKP野生株莢膜多糖含量明顯高于blaKPC-2過表達(dá)株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖4B。

圖4 hvKP野生株與blaKPC-2轉(zhuǎn)化株莢膜多糖含量及黏液性測(cè)定Figure 4 Capsular polysaccharide production and mucoviscosity of hvKP wild-type and blaKPC-2 transformants

2.4 blaKPC-2轉(zhuǎn)化株莢膜多糖結(jié)構(gòu)基因及黏液表型相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化

hvKP野生株與blaKPC-2轉(zhuǎn)化株莢膜多糖結(jié)構(gòu)基因及黏液相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異經(jīng)RT-PCR方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，blaKPC-2轉(zhuǎn)化株3個(gè)結(jié)構(gòu)基因（galF、wzi、manC）及黏液表型相關(guān)基因（rmpA、rmpA2）表達(dá)下調(diào)30%～70%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

圖5 hvKP野生株與blaKPC-2轉(zhuǎn)化株莢膜多糖結(jié)構(gòu)基因（A）及黏液相關(guān)基因（B）轉(zhuǎn)錄水平差異Figure 5 Transcriptional levels of capsular polysaccharide construction genes (A) and mucoviscosity related genes (B) in hvKP wild-type and blaKPC-2 transformants

3 討論

隨著抗生素使用及細(xì)菌間可移動(dòng)元件的傳播擴(kuò)散，新的超級(jí)細(xì)菌不斷出現(xiàn)。近年來，自浙江地區(qū)2019年首次報(bào)道了CR-hvKP后，該菌在臨床上檢出率越來越高，且已經(jīng)出現(xiàn)了由CR-hvKP引起的醫(yī)院暴發(fā)感染的報(bào)道[15]。然而hvKP獲得碳青霉烯類耐藥基因如blaKPC-2后，對(duì)于細(xì)菌毒力的影響至今報(bào)道較少。近年來，眾多研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌有多方面的影響。有學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌獲得耐藥性后會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌毒力，也有學(xué)者認(rèn)為會(huì)降低細(xì)菌毒力。Pozzi等[16]研究表明，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）可通過影響細(xì)菌生物膜表型、降低細(xì)菌蛋白酶產(chǎn)生而降低細(xì)菌致病力，此外，MRSA還可通過干擾細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)下調(diào)毒力細(xì)菌毒力基因表達(dá)。Choi等[17]通過體外改變hvKP脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)構(gòu)建黏菌素耐藥菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生株相比，黏菌素耐藥株黏液表型下降，莢膜多糖含量降低，毒力基因magA和rmpA2表達(dá)下降，細(xì)菌毒力降低。

本研究通過體外過表達(dá)blaKPC-2并轉(zhuǎn)化hvKP的方法構(gòu)建blaKPC-2轉(zhuǎn)化株，比較同一遺傳背景下細(xì)菌獲得耐藥性后對(duì)毒力的潛在影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hvKP獲得blaKPC-2后細(xì)菌對(duì)血清中殺菌物質(zhì)的抵抗能力下降，生物被膜形成能力下降，細(xì)菌黏液性下降，莢膜多糖結(jié)構(gòu)基因及調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平下降，莢膜多糖產(chǎn)生量降低，即細(xì)菌毒力降低。然而Siu等[18]通過接合實(shí)驗(yàn)將blaKPC-2和blaKPC-3接合至K1型hvKP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hvKP仍對(duì)血清中殺菌物質(zhì)保持較高的抵抗能力及毒力。本研究與其他研究結(jié)果的差異可能與細(xì)菌獲得耐藥的途徑不同，本研究所采用的是過表達(dá)blaKPC-2，而Siu等[18]采用接合實(shí)驗(yàn)的方法使hvKP野生株產(chǎn)生耐藥。此外，研究結(jié)果不同可能與實(shí)驗(yàn)所選取的細(xì)菌本身的遺傳背景等有關(guān)。

無論細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌毒力是增強(qiáng)還是減弱，都是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境后，向有利于細(xì)菌生存方向發(fā)展的表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示肺炎克雷伯菌獲得碳青霉烯類耐藥后會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒力因子莢膜多糖量降低，但是臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了高毒力、高耐藥菌株導(dǎo)致患者死亡的案例[15]，這些超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)會(huì)給臨床抗感染治療帶來極大的威脅，研究細(xì)菌毒力與耐藥性之間的關(guān)系對(duì)于臨床感染性疾病的診斷、治療及預(yù)防十分重要。