HBeAg陽性慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中分泌IL-21的CD4+ T細(xì)胞頻數(shù)的檢測及臨床意義

范清琪， 汪 婷， 陳沛冬， 汪月娥

機(jī)體感染乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）后，在HBV特異性抗原刺激下，CD4+T細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的作用下分化為輔助性T細(xì)胞（Thl、Th2、Thl7）及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），影響細(xì)胞因子之間的網(wǎng)絡(luò)平衡。白細(xì)胞介素21（IL-21）是一個(gè)多功能、多效應(yīng)的細(xì)胞因子，在細(xì)胞免疫應(yīng)答中起至關(guān)重要的作用，其主要由活化的CD4+T細(xì)胞分泌。CD4+T細(xì)胞分泌的 IL-21 還可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的分泌，增強(qiáng) HBV 感染過程中CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和殺傷功能，在清除病毒和控制慢性感染中發(fā)揮重要作用。CD4+T細(xì)胞與細(xì)胞因子（如IL-21）間的表達(dá)調(diào)節(jié)失衡與HBV感染后慢性乙型病毒性肝炎（慢乙肝）的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。本研究檢測復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院乙肝病毒e抗原（HBeAg）陽性慢乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-21頻數(shù)，結(jié)合患者的臨床資料、乙肝表面抗原（HBsAg）定量及IL-21等指標(biāo)，輔助判斷經(jīng)核苷（酸）類似物抗病毒治療的結(jié)局。

1 材料與方法

1.1 病例來源

收集自2010年1月—2019年1月在我院肝病門診就診的患者67例，所有患者診斷均符合中國《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》，并排除合并有甲型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎，HIV，肝硬化，肝衰竭和肝癌等的患者。收集67例使用核苷（酸）類似物進(jìn)行抗病毒治療的HBeAg陽性慢乙肝患者，抗病毒治療后，其中出現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換慢乙肝患者39例，而治療至少3年以上仍為HBeAg陽性者28例。

1.2 方法

1.2.1 血清HBV DNA、HBsAg定量檢測 患者血清HBV DNA定量水平采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）檢測；HBsAg的檢測采用羅氏的Cobas e601全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀，試劑盒由羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司提供，未稀釋樣本的線性范圍是0.05～130 U/mL，進(jìn)行1∶400稀釋后，樣本線性范圍是20～52 000 U/mL。

1.2.2 IL-21的檢測 采用雙抗體夾心ELISA，檢測儀器為MK3酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，Thermo-Electron Corporation，USA），試劑盒由美國R&D公司提供。血清檢測孔中先加樣本稀釋液40 μL，再加待測血清10 μL，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1 600 ng/L，按 800、 400、200、 100、50 ng/L 濃度對倍稀釋，共5孔，每孔加標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，同時(shí)做空白孔。封板后混勻，室溫孵育2 h后洗滌，洗滌5次，每次1 min。除空白孔外各反應(yīng)孔加入1×Avidin-HRP抗體50 μL，室溫孵育45 min，同上洗滌。每孔加入顯色底物TMB 100 μL，避光10 min，每孔加入100 μL終止液，30 min內(nèi)酶標(biāo)儀在450 nm波長測定光密度D值（參考波長630 nm），通過標(biāo)準(zhǔn)品濃度和其D值擬合線性回歸曲線，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算血清中IL-21的水平。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中分泌IL-21的CD4+T細(xì)胞（CD4+IL-21+T細(xì)胞）的頻數(shù) 取患者肝素抗凝全血標(biāo)本250 μL，用RPMI1640懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基1∶1等體積稀釋到500 μL。再在標(biāo)本中加入能刺激CD4+T細(xì)胞分化的250X PMA/Ionomycin 2 μL和能使細(xì)胞因子不能分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑250XMonensin/BFA 2 μL，混勻后，在 37℃， 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4～6 h。取兩支流式管，標(biāo)記為對照組和實(shí)驗(yàn)組，分別加入100 μL培養(yǎng)好的全血及流式抗體CD45-KO/CD3-ECD/CD8-PE 各 10 μL。4℃ 避 光 孵 育30 min，加入固定破膜劑A 100 μL，室溫避光孵育15 min，加入PBS，500×g離心5 min，棄上清液收集細(xì)胞，加入固定破膜劑B 100 μL，渦旋，室溫避光孵育15 min。分別在對照組管和實(shí)驗(yàn)組管中加入 IgG1-Alexa Fluor?647 和 IL-21-Alexa Fluor?647抗體各20 μL，混勻，室溫孵育30 min，加入PBS，500×g離心5 min，棄上清液收集細(xì)胞，用0.5 mL PBS重懸后在美國貝克曼Navios流式細(xì)胞儀上檢測，并繪制出細(xì)胞頻數(shù)圖。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Stata13.1統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，兩組間的計(jì)量資料通過均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的方式來表示，組間比較用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較用卡方檢驗(yàn)。采用logistic回歸分析方法分析慢乙肝患者抗病毒治療結(jié)局可能的影響因素。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體情況及臨床資料比較

共67例HBeAg陽性慢乙肝患者入組，其中男42例，女25例。接受核苷（酸）類似物治療后出現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換慢乙肝患者39例，仍為HBeAg陽性者28例。兩組患者基線資料見表1。67例患者中接受拉米夫定6例、阿德福韋酯7例、恩替卡韋34例、替諾福韋7例、替比夫定5例、拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯8例。兩組患者的臨床資料經(jīng)分析可見，HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換組和HBeAg持續(xù)陽性組的年齡（P=0. 963）、基線時(shí)的ALT（P=0.071）、HBV DNA（P=0.716）以及用藥療程（P=0.589）之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 外周血IL-21、HBsAg定量以及CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)的比較

HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換組的IL-21較HBeAg持續(xù)陽性組高而HBsAg定量則較低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.004、0.028。見表1。HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換組中CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)為（1.22±0.36）%，HBeAg持續(xù)陽性組中為（0.89±0.25）%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。圖1為HBeAg持續(xù)陽性組患者的CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)圖，圖2為HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換組慢乙肝患者的CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)圖。

圖1 HBeAg持續(xù)陽性組患者的CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)Figure 1 Frequency of CD4+IL-21+ T cells in patients with persistent positive HBeAg

圖2 HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換組慢乙肝患者的CD4+IL-21 +T細(xì)胞頻數(shù)Figure 2 Frequency of CD4+IL-21+ T cells in chronic hepatitis B patients with HBeAg negative or serum conversion

表1 67例HBeAg陽性慢乙肝患者的臨床資料比較Table 1 Clinical characteristics of chronic hepatitis B patients in terms of HBeAg status

2.3 HBeAg陽性慢乙肝患者抗病毒治療結(jié)局的相關(guān)因素分析

采用logistic回歸分析，探討療程、基線HBV-DNA水平、ALT水平、IL-21濃度、HBsAg水平、CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)與抗病毒治療后HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換的關(guān)系。單因素分析顯示， CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)（OR=28.656，95%CI2.929～280.394，P=0.004）、HBsAg水平（OR=0.999，95%CI0.998～0.999；P=0.023）和 IL-21（OR=1.002，95%CI1.001～1.004；P=0.007）與抗病毒治療后HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換有關(guān)。見表2。多因素分析則提示CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)（OR=36.118，95%CI4.744～274.982，P=0.001）、HBsAg 水 平（OR=0.999，95%CI0.998～0.999，P=0.026）與抗病毒治療后HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換有關(guān)。見表3。

表2 HBeAg陽性慢乙肝患者經(jīng)核苷類似物治療后出現(xiàn)應(yīng)答的相關(guān)變量單因素分析Table 2 Univariate analysis of the variables associated with complete response to anti-HBV nucleosides analogs therapy among HBeAg-positive chronic hepatitis B patients

表3 HBeAg陽性慢乙肝患者經(jīng)核苷類似物治療后出現(xiàn)應(yīng)答的相關(guān)變量多因素分析Table 3 Multivariate analysis of the variables associated with complete response to anti-HBV nucleosides analogs therapy among HBeAg-positive chronic hepatitis B patients

3 討論

世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球慢性HBV感染者約有2.57億[3]。在我國，一般人群中HBsAg流行率為5%～6%，其中慢乙肝患者有2 000萬～3 000萬例[4]。慢乙肝患者中，在病毒的特異性抗原刺激下，淋巴細(xì)胞亞群功能產(chǎn)生失衡、紊亂，并造成特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)顯著降低、功能耗竭[5-7]。而高水平的HBeAg也會引起T細(xì)胞亞群失衡，與肝損傷及HBV并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)[8]。HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換對HBV介導(dǎo)的免疫調(diào)控起到一定的改善作用，并可能進(jìn)一步阻止患者進(jìn)展為終末期肝病，是目前臨床上的重要治療目標(biāo)。因此，本研究的目的是確定HBeAg陽性慢乙肝患者抗病毒治療發(fā)生HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換的預(yù)測因素。

本研究結(jié)果顯示，在多因素分析中HBsAg水平（OR=0.999，95%CI0.998～0.999，P=0.023）與抗病毒治療后HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換有關(guān)，這與Shen等[9]研究結(jié)果相似。目前HBsAg的水平還用于預(yù)測慢乙肝患者停用核苷（酸）類似物治療后復(fù)發(fā)可能的研究[10]。

IL-21現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于預(yù)測HBeAg陽性的慢乙肝患者發(fā)生HBeAg消失或者血清轉(zhuǎn)換[11]。IL-21及其下游效應(yīng)細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）能夠有效抑制HBV復(fù)制，促進(jìn)HBV感染患者抗病毒治療的結(jié)局與轉(zhuǎn)歸[12]。Ma等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IL-2l水平的升高與慢乙肝抗病毒的治療應(yīng)答有關(guān)。治療12周時(shí)的IL-2l水平與HBeAg血清轉(zhuǎn)換相關(guān)，并可進(jìn)一步預(yù)測治療1年后HBeAg陰轉(zhuǎn)或者血清轉(zhuǎn)換。本研究顯示，HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換組中IL-21水平雖高于HBeAg持續(xù)陽性組，P值為0.004，但在多因素分析中，兩組差異卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然這種差異可能是由于目前研究的樣本量小造成，但是也有可能與IL-21的基線水平無法有效評估HBeAg陽性慢乙肝患者抗病毒的結(jié)局有關(guān)。隨著抗病毒治療療程的進(jìn)展，IL-21水平的變化是否會與HBeAg的清除存在一定的相關(guān)性，我們將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探究。

T細(xì)胞膜表面有100多種特異性抗原，1986 年，WHO將這100多種特異性抗原統(tǒng)稱為白細(xì)胞分化抗原（cluster differentiation，CD）。CD4+IL-21+T細(xì)胞是IL-21的主要來源。有研究顯示，HBeAg陽性慢乙肝患者的CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)相較于健康人群明顯升高[14]。而表達(dá)趨化因子受體5型的CD4+T細(xì)胞（CXCR5+CD4+T細(xì)胞）可誘導(dǎo)機(jī)體B細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生HBeAb，有利于HBeAg的消失或血清學(xué)轉(zhuǎn)換，提示可能與HBeAg陽性慢乙肝患者的優(yōu)化治療相關(guān)。Cooksley等[15]研究顯示，HBeAg陽性慢乙肝患者經(jīng)過阿德福韋酯治療后，HBeAg消失或血清轉(zhuǎn)化可能與 CD4+T細(xì)胞對HBV免疫應(yīng)答增強(qiáng)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg陰轉(zhuǎn)或血清轉(zhuǎn)換組CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)明顯高于HBeAg持續(xù)陽性組（P＜0.001）。多因素分析結(jié)果更提示，CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)可用于預(yù)測HBeAg陽性慢乙肝患者抗病毒治療結(jié)局。

本研究存在一定的局限性，收集的患者例數(shù)相對較少、隨訪時(shí)間短、選擇用于統(tǒng)計(jì)的可能影響因子有一定的片面性等問題，但從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，CD4+IL-21+T細(xì)胞頻數(shù)和HBsAg定量可用于慢乙肝患者抗病毒治療結(jié)局的預(yù)測，可在臨床實(shí)踐中進(jìn)一步完善。