血液病患者產(chǎn)毒艱難梭菌無癥狀定植和感染相關(guān)危險(xiǎn)因素的前瞻性研究

王 潔， 楊 靖， 劉曉雷， 強(qiáng)翠欣， 李志榮， 牛亞楠， 曹 靜， 趙建宏

艱難梭菌相關(guān)性腹瀉（Clostridioides difficileassociated diarrhea， CDAD）是艱難梭菌定植腸道后，過度增殖并釋放毒素引起的以腸道癥狀為主要表現(xiàn)的感染性疾病，臨床表現(xiàn)可從輕度的自愈性腹瀉到嚴(yán)重的偽膜性腸炎[1-2]。

國內(nèi)針對(duì)無癥狀艱難梭菌定植發(fā)生率和危險(xiǎn)因素的研究較少，在臨床工作中被嚴(yán)重低估。由于血液病患者基礎(chǔ)疾病復(fù)雜，有多種已知的艱難梭菌感染（CDI）危險(xiǎn)因素，如抗生素使用率高、化療、住院時(shí)間長和免疫缺陷等，研究表明白血病或淋巴瘤的血液病患者易發(fā)生CDI[3-4]。然而，血液病患者是否容易發(fā)生產(chǎn)毒艱難梭菌定植（toxigenicClostridioides difficilecolonization, tCDC）以及發(fā)生感染的危險(xiǎn)因素尚不清楚。本研究對(duì)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科住院患者tCDC的發(fā)生率和危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，為早期識(shí)別和預(yù)防隔離提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2013年3—9月血液病房新入院的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥15周歲，住院時(shí)間≥3 d；排除標(biāo)準(zhǔn)：患者入院時(shí)被診斷為CDAD，患者入院前2個(gè)月內(nèi)有tCDC或CDAD病史，患者有結(jié)腸切除史，需要臨終關(guān)懷的患者，未簽署知情同意書者，入院后48 h內(nèi)無便者。信息不完整以及中途退出者不納入分析。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)為2013L-21。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患者的臨床基本信息，包括年齡、基礎(chǔ)疾病、Charlson合并癥指數(shù)、住院史、抗生素使用等。

1.2.2 糞便標(biāo)本采集 患者在入院48 h內(nèi)、每周以及隨時(shí)發(fā)生腹瀉時(shí)分別收集糞便標(biāo)本，標(biāo)本在2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。本研究的主要臨床結(jié)局是入院后發(fā)生CDAD，未發(fā)生CDAD的患者追蹤至出院或死亡。不采集再次入院血液病患者的糞便標(biāo)本。

1.2.3 艱難梭菌分離和鑒定 取糞便標(biāo)本與無水乙醇等比例混合均勻，室溫靜置1 h，4 000×g離心10 min，取沉淀物接種于艱難梭菌拉氧頭孢諾氟沙星（CDMN）選擇性培養(yǎng)基（OXOID，Cambridge， UK），37℃厭氧培養(yǎng) 48～72 h。可疑菌落通過 VITEK 2 ANC 卡（Bio Mérieux， Lyon，F(xiàn)rance）鑒定。

1.2.4 DNA提取和基因檢測(cè) 提取艱難梭菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)[5]，包括tcdA、tcdB、cdtA、cdtB、16S rDNA。 反 應(yīng) 體 系 為 25 μL：2×Taq MasterMix 12.5 μL；DNA 模板 3 μL；ddH2O 9.5 μL。所得產(chǎn)物取6 μL點(diǎn)樣于2%～3%的瓊脂糖凝膠，電泳條件為100 V電壓，80～100 min 后，將膠塊置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察有無特異性擴(kuò)增的條帶。

1.2.5 核糖體分型 檢測(cè)艱難梭菌16S～23S間隔區(qū)的多態(tài)性， 所用引物分別來自16S和23S[5]。3%瓊脂糖凝膠100 V電泳4 h分離PCR產(chǎn)物，采用100 bp的DNA梯狀圖對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以艱難梭 菌 RT001（ATCC 9689）、RT012（ATCC BAA-1382）、RT017（ATCC 43598）、RT 027（ATCC BAA-1870）為參考菌株，與參考菌株型別不一致的，本實(shí)驗(yàn)室使用HB前綴進(jìn)行命名。

1.2.6 定義 腹瀉定義為24 h內(nèi)不少于3次不成形便；tCDC定義為培養(yǎng)陽性但無腹瀉癥狀；CDAD定義為患者發(fā)生無法用其他原因解釋的腹瀉同時(shí)產(chǎn)毒艱難梭菌培養(yǎng)陽性；醫(yī)院獲得性艱難梭菌定植或感染定義為入院后72 h或更長時(shí)間發(fā)生的艱難梭菌定植或感染[6]。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。單因素分析：連續(xù)型變量使用Student-t檢驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；分類變量使用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切檢驗(yàn)。多因素分析：采用logistic回歸分析。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本采集及菌株分型

7個(gè)月期間共180例血液病新住院患者符合入選標(biāo)準(zhǔn)，其中15例拒絕簽署知情同意書退出，25例入院后48 h內(nèi)無便，28例中途退出實(shí)驗(yàn)，7例信息不全，最終105例患者納入研究。共收集218份糞便標(biāo)本，從29例患者的糞便中篩選出艱難梭菌共45株，均為A、B毒素基因同時(shí)陽性[tcdA（+）/tcdB（+）/cdtA（-）/cdtB（-）]，未檢出二元毒素基因。核糖體分型為12個(gè)型別，RT001和RT012為主要流行型別，占66.7%（30/45），與參考菌株型別不一致的命名為HB，按鑒定的順序進(jìn)行編號(hào)（圖1）。RT001和RT012的多位點(diǎn)序列分型（MLST）基因型分別為ST3和ST54[5]。在這45株菌株中未檢測(cè)到艱難梭菌RT027型高產(chǎn)毒株。

圖1 45株產(chǎn)毒艱難梭菌的PCR核糖體分型Figure 1 PCR ribosomal typing of 45 strains of toxigenic C. difficile

2.2 發(fā)病率和臨床結(jié)局

105例患者，平均年齡46.6歲，男性占49.5%（52/105）。29例患者（27.6%，29/105）有tCDC，其中21例（72.4%，21/29）入院時(shí)有無癥狀tCDC，8例（27.6%，8/29）在入院后發(fā)生醫(yī)院獲得性tCDC；29例tCDC患者中6例（20.7%，6/29）在住院期間發(fā)生了CDAD，其中4例為入院時(shí)有定植者，2例為醫(yī)院獲得性定植者，23例出院前為無癥狀攜帶者。另76例患者至出院未發(fā)生定植或感染。

2.3 入院時(shí)有tCDC的危險(xiǎn)因素

單因素分析顯示，入院時(shí)21例有tCDC患者與84例無tCDC患者相比，入院前2個(gè)月內(nèi)有住院史（66.7%對(duì)31.0%，P=0.003）、入院前30 d內(nèi)有抗生素使用史（61.9%對(duì)14.3%，P＜0.001）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組患者在年齡、性別、入院前30 d內(nèi)糖皮質(zhì)激素使用史、基礎(chǔ)疾病或Charlson 合并癥指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。多因素回歸分析顯示，入院前30 d內(nèi)有抗生素使用史差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=18.569， 95 %CI：2.604～132.431，P=0.004），是入院時(shí)有 tCDC 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表1）。

表1 105例患者入院時(shí)有tCDC與無tCDC的臨床特征和多因素回歸分析Table 1 Clinical characteristics and multivariable analysis of 105 patients with or without toxigenic C. difficile colonization （tCDC） at the time of admission

2.4 醫(yī)院獲得性tCDC的危險(xiǎn)因素

84例患者在入院時(shí)無tCDC，入院后有8例（9.5%，8/84）發(fā)生醫(yī)院獲得性tCDC。單因素分析顯示，兩組患者比較，發(fā)生醫(yī)院獲得性tCDC的患者年齡高于未發(fā)生tCDC的患者（58.2歲對(duì)53.2歲，P＜0.001），且住院時(shí)間更長（29.0 d對(duì)15.0 d，P=0.003）。在治療用藥上，患者入院后使用碳青霉烯類抗生素（37.5%對(duì)7.9%，P=0.037）更易發(fā)生醫(yī)院獲得性tCDC，使用其他抗生素、化療藥物或質(zhì)子泵抑制劑（PPI）等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。然而多因素回歸分析顯示，年齡、住院時(shí)間、入院后使用碳青霉烯類抗生素等變量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 入院時(shí)無tCDC的84例患者在入院后發(fā)生與未發(fā)生醫(yī)院獲得性tCDC患者的臨床特征Table 2 Clinical characteristics of 84 patients without toxigenic C. difficile colonization （tCDC） at the time of admission who subsequently developed healthcare-associated tCDC or did not

2.5 發(fā)生CDAD的危險(xiǎn)因素

單因素分析顯示，6例發(fā)生CDAD的患者與99例至出院未發(fā)生CDAD的患者相比，之前有tCDC（100 %對(duì)23.2%，P=0.001）的更容易在住院過程中發(fā)生CDAD，住院時(shí)間（32.0 d對(duì)15.8 d，P=0.003）、入院后使用兩種及以上抗生素（66.7%對(duì)23.2%，P=0.037）、使用糖肽類抗生素（50.0%對(duì)11.1%，P=0.030）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而多因素回歸分析顯示，住院時(shí)間、使用抗生素等變量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

在此前的研究中，健康成人的tCDC發(fā)生率為3.6%[5]。一項(xiàng)薈萃分析回顧了北美、歐洲和亞洲入院時(shí)無癥狀tCDC的合并發(fā)生率為8.1%（95%CI：5.7%～11.1%）[7]。長期受醫(yī)療護(hù)理人群中約14.8%是產(chǎn)毒艱難梭菌的無癥狀攜帶者[8]。在本研究中有20.0%（21/105）的血液病房新入院患者入院時(shí)有tCDC，有7.6%（8/105）發(fā)生醫(yī)院相關(guān)性tCDC，因此，血液病房住院患者tCDC發(fā)生率為27.6%，高于其他研究報(bào)道。本研究選擇血液病患者，患者基礎(chǔ)疾病復(fù)雜，有多種已知的CDI危險(xiǎn)因素，如抗生素使用率高、化療、住院時(shí)間長和免疫缺陷等。既往研究報(bào)道白血病或淋巴瘤的血液病患者容易發(fā)生CDI（OR=2.3，95%CI：1.6～3.2）[3-4]，而引起CDI的危險(xiǎn)因素也容易引起tCDC。本研究沒有檢出其他研究中檢出率高的RT027型高產(chǎn)毒株，檢出的主要流行型別為RT001（ST3）和RT012（ST54），與河北省健康成年人、健康嬰兒和腹瀉成人中的流行型別相同[5]。

本研究中，過去2個(gè)月內(nèi)有住院史或過去30 d內(nèi)有抗生素使用史的患者在入院時(shí)有較高的tCDC發(fā)生率。過去30 d內(nèi)有抗生素使用史是入院時(shí)有tCDC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。醫(yī)院是艱難梭菌傳播的重要來源，艱難梭菌芽孢可以在環(huán)境中長期存在，患者在住院過程中可能會(huì)從醫(yī)院環(huán)境中獲得艱難梭菌芽孢，然后發(fā)生定植，如果成為無癥狀攜帶者，再次入院時(shí)會(huì)向環(huán)境中播散芽孢污染環(huán)境引起更多的CDI病例[6，9-10]?？股乇┞?，特別是廣譜抗生素，它們能破壞腸道微生物群、降低菌群多樣性，增加了腸道對(duì)艱難梭菌的易感性[11-14]。

單因素分析顯示，高齡、住院時(shí)間長、使用碳青霉烯類藥物治療的患者更容易發(fā)生醫(yī)院獲得性tCDC；使用≥2種抗生素、使用糖肽類抗生素、住院時(shí)間長更易發(fā)生CDAD。然而可能由于病例數(shù)量限制，多因素回歸分析顯示，上述變量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需加大樣本量繼續(xù)研究。

本研究中，6例發(fā)生CDAD的患者，住院之前均發(fā)生了tCDC。tCDC患者在隨后的住院中更容易發(fā)生CDAD，這一發(fā)現(xiàn)與其他研究結(jié)果一致[15-16]。一項(xiàng)系統(tǒng)回顧研究顯示，入院時(shí)有tCDC的患者發(fā)生CDAD的風(fēng)險(xiǎn)是無tCDC患者的5.9倍[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，無癥狀的tCDC患者和CDAD患者的腸道微生物菌群豐富性和多樣性均降低，然而，這兩組的微生物菌群結(jié)構(gòu)并不相同[13]。tCDC患者的微生物菌群豐富性和多樣性雖然降低，但降低后菌群結(jié)構(gòu)不足以發(fā)生CDAD。隨著腸道菌群的進(jìn)一步破壞和產(chǎn)毒艱難梭菌的過度生長，tCDC患者的腸道菌群更容易發(fā)展成為CDAD患者的微生物菌群結(jié)構(gòu)。因此，tCDC是發(fā)展為CDAD的必要過程。

綜上所述，與其他研究相比，本研究血液病患者tCDC發(fā)生率較高?？股厥褂檬前l(fā)生tCDC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而無癥狀定植患者更容易在住院過程中發(fā)生CDAD。本研究通過研究艱難梭菌定植的發(fā)生率和危險(xiǎn)因素，為艱難梭菌的篩查和預(yù)防提供了依據(jù)。