雞胚接毒量對新城疫病毒LaSota 株增殖的探究

胡江鋒 胡春艷 張小娟

1.楊凌綠方生物工程有限公司 712100

2.陜西省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心 712100

3.陜西諾威利華生物科技有限公司 712100

雞新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞和火雞，其他禽類和野禽也能感染，亦可感染人。本病于1926 年首次發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞，隨后又發(fā)現(xiàn)于英國的新城，我國最早的報道見于1935 年的河南，20 世紀(jì)50 年代本病在全國各地廣泛流行。本病常呈敗血癥經(jīng)過，其特征是呼吸困難、下痢和神經(jīng)癥狀，死亡率高，可造成很大的經(jīng)濟損失。本病是危害我國養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的禽病之一，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。動物傳染病防控的主要環(huán)節(jié)是消滅傳染源、切斷傳播途徑和保護易感畜禽，疫苗免疫是保護畜禽健康的重要措施。雞新城疫疾病的預(yù)防主要依靠疫苗免疫來提高機體的抗病力，實現(xiàn)保護畜禽健康的目的。目前，我國生產(chǎn)的雞新城疫疫苗有活疫苗和滅活疫苗兩大類，活疫苗用于雞群前期的基礎(chǔ)免疫，滅活疫苗用在雞群后期的加強免疫。不論活疫苗還是滅活疫苗，廣泛使用NDV-LaSota 株種毒接種雞胚進行病毒增殖，收獲雞胚液作為制苗用抗原。疫苗的抗原含量越高，刺激機體產(chǎn)生的抗體越多，保護力也越強，因此，病毒抗原含量是保障疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵，另外雞胚的抗原收獲量影響著生產(chǎn)成本。此試驗從雞胚的接毒量入手，探索出了SPF 雞胚生產(chǎn)NDV-LaSota 株抗原時，雞胚適宜接毒量的量化指標(biāo)，不但給實際生產(chǎn)提供了指導(dǎo)依據(jù)，而且所生產(chǎn)的病毒抗原含量和收獲量均有了提高，保證了產(chǎn)品質(zhì)量，而且降低了生產(chǎn)成本，有利于雞新城疫病的防控工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種毒NDV-LaSota 株，批號20210302，病毒含量—雞胚半數(shù)感染量（EID50）≥109.38/0.1mL，由楊凌綠方生物工程有限公司質(zhì)量管理部提供。

1.1.2 SPF 雞胚SPF 雞蛋購自濟南賽福實驗動物養(yǎng)殖有限公司，經(jīng)楊凌綠方生物工程有限公司前孵化班孵化提供。

1.1.3 主要試劑生理鹽水、PBS（0.1mol/L，pH7.0～7.2）、1%雞紅細(xì)胞懸液，由陜西省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.4 主要儀器設(shè)備孵化機，青島興儀電子設(shè)備有限公司；冰柜，澳柯瑪集團有限公司；微量板振蕩器，金壇市正基儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種毒稀釋將NDV-LaSota 株種毒用生理鹽水按5個組別分別稀釋2.4×106、4.8×105、2.4×105、4.8×104、2.4×104倍，使0.1mL 稀釋液含病毒量對應(yīng)為1000EID50、5000EID50、10000EID50、50000EID50、100000EID50。

1.2.2 雞胚接種將10 日齡的SPF 雞胚1000 枚，隨機分為5 組，200 枚/組，先用5%碘酊消毒雞胚氣室及接種點部位，1～2min 后再用75%酒精脫碘；用打孔蛋錐在接種點和氣室頂部各鉆一小孔。用卡介苗注射器吸取種毒稀釋液，按0.1mL/胚尿囊腔接種SPF 雞胚，接種病毒含量為1000EID50種毒稀釋液的一組雞胚，標(biāo)記為A 組，接種病毒含量為5000EID50種毒稀釋液的一組雞胚，標(biāo)記為B 組，接種病毒含量為10000EID50種毒稀釋液的一組雞胚，標(biāo)記為C組，接種病毒含量為50000EID50種毒稀釋液的一組雞胚，標(biāo)記為D 組，接種病毒含量為100000EID50種毒稀釋液的一組雞胚，標(biāo)記為E 組。接種完用石蠟先封接種孔，再封氣室孔。

1.2.3 孵育觀察接種、封孔完畢的SPF 雞胚置36℃～37℃、相對濕度60%～65%的孵化機繼續(xù)孵育，不必翻蛋；將60h 前死亡胚棄去，60h 后每隔6～8h 照蛋一次，死亡的雞胚隨時取出，保存于2℃～8℃冰柜，至96h，不論死亡與否，全部取出，氣室向上置于2℃～8℃冰柜冷卻。

1.2.4 雞胚液收獲按組別分別將冷卻4～24h 的SPF 雞胚取出，先用1%新潔爾滅擦拭消毒整個雞胚，再用5%碘酊消毒氣室部位。用眼科剪刀無菌剪除氣室蛋殼，再用眼科鑷子揭去卵殼膜，接著刺破絨毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黃破裂，將胚胎及卵黃移至蛋殼內(nèi)一側(cè)，同時于另一側(cè)無菌吸取雞胚液（尿囊液和羊水的合稱），計量后置于滅菌容器中，留取樣品備檢。在收獲雞胚液的同時應(yīng)逐個檢查，凡胚胎腐敗及雞胚液混濁者棄去不用。另外，收獲完一組雞胚液，須更換工器具再收獲另一組雞胚液。

1.2.5 雞胚液病毒含量測定將5 組檢驗留樣用PBS 分別進行10 倍系列稀釋至10-9，每組取10-7、10-8、10-93 個稀釋度分別尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚5 枚，0.1mL/胚，封孔后置36℃～37℃、相對濕度60%～65%的孵化機繼續(xù)孵育，觀察5d。接種后，48h 前死亡的雞胚棄去不計，48～120h死亡的雞胚隨時取出，保存于2℃～8℃冰柜，至120h，取出所有活胚，氣室向上置于2℃～8℃冰柜冷卻4～24h 后，收取同一稀釋度的死亡雞胚胚液，混合并留樣，活胚逐個收取雞胚液樣品。按紅細(xì)胞凝集試驗法，用96 孔微量板分別測定收獲的雞胚液留樣的HA，HA≥27者判為感染，按Reed-Muench 法分別計算各組雞胚液的EID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胚液收獲量比較各組SPF 雞胚接毒后的孵育觀察情況及雞胚液的收獲量見表1。

表1 接毒雞胚的孵育觀察情況及雞胚液收獲量

從表1 看出，用SPF 雞胚生產(chǎn)NDV-LaSota 株抗原時，隨著雞胚接毒量的增大，其60～96h 區(qū)間死亡的雞胚也逐漸增多，96h 存活雞胚相應(yīng)逐漸減少，收獲的雞胚液總量也逐漸減少。說明接毒后96h 存活的雞胚比60～96h 區(qū)間死亡的雞胚胚液收獲量大，可能雞胚死亡越早，胚液收獲量越小。因此，單以雞胚液收獲量指標(biāo)考評，A 組、B 組和C 組的雞胚接毒量比較合適。

2.2 雞胚液的病毒含量各組收獲的雞胚液病毒含量測定結(jié)果見表2。

表2 雞胚液的病毒含量

從表2 看出，生產(chǎn)NDV-LaSota 株抗原時，A 組和B 組收獲的雞胚液病毒含量較低，C 組、D 組和E 組收獲的雞胚液病毒含量較高，約是A 組的10 倍，但C 組、D 組和E 組之間無差異。說明雞胚增殖NDV-LaSota 株抗原時，接毒量過小，一定時間內(nèi)病毒增殖達不到高峰；當(dāng)接毒量達到一定量，就能獲得高病毒含量的雞胚液，若進一步增大接毒量，不足以引起病毒更高的增殖效果，提高不了雞胚液病毒含量。因此，單以雞胚液病毒含量指標(biāo)考評，C 組、D 組和E 組的雞胚接毒量比較合適。

綜上，在用SPF 雞胚生產(chǎn)NDV-LaSota 株抗原時，接毒量以10000EID/胚為宜，這樣一方面能提高所產(chǎn)雞胚液的病毒含量，另一方面還能增加雞胚液的收獲量。

3 結(jié)論與討論

畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康運營離不開疫病的防控，通過疫苗免疫接種來激發(fā)動物機體產(chǎn)生特異性抗體，當(dāng)抗體達到一定濃度，就有了可靠的抵抗力，避免疫病的發(fā)生及流行。疫苗的質(zhì)量是影響免疫效果的關(guān)鍵因素，疫苗生產(chǎn)所用的抗原含量是疫苗質(zhì)量的保證。本試驗探索出了SPF 雞胚生產(chǎn)NDVLaSota 株抗原，合適的雞胚接毒量為10000EID50/胚，這樣既能達到一定時間內(nèi)，增殖病毒所獲得的雞胚液病毒含量較大，從而保證了抗原質(zhì)量，又能降低接毒雞胚60～96h 區(qū)間的死亡率，以增大雞胚液的收獲量，降低生產(chǎn)成本，這與高等職業(yè)教育教材的觀點“通常雞胚發(fā)育至13～15 日齡，尿囊液含量最高”相一致。本試驗只針對SPF 雞胚增殖NDVLaSota 株抗原時的接毒量進行了探究，結(jié)果有一定的局限性，其他雞胚增殖NDV-LaSota 株抗原或不同雞胚增殖其他病毒的適宜接毒量方面仍有待研究。