口蹄疫滅活疫苗保存及穩(wěn)定性研究

劉國民 高日明 尚策 宋慶慶 王凱 陳炳全 朱修澤/金宇保靈生物藥品有限公司 010030

口蹄疫滅活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S）是重要的免疫抗原，其含量、完整性、穩(wěn)定性決定了疫苗的免疫效果?？谔阋卟《臼菬o囊膜病毒，對氯仿不敏感，對溫度、酸堿度比較敏感，當(dāng)pH 變化或溫度升高時(shí)完整病毒146S容易分解。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果將大幅度降低。生產(chǎn)中如何保護(hù)146S 抗原完整性以及保證疫苗純度是工藝攻關(guān)難點(diǎn)。完整病毒粒子配合優(yōu)質(zhì)佐劑，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，進(jìn)而保護(hù)易感動(dòng)物不被口蹄疫病毒感染，最終使口蹄疫滅活疫苗起到防控疫病的作用。

疫苗生產(chǎn)是系統(tǒng)工程，包括細(xì)胞培養(yǎng)、病毒放大生產(chǎn)、純化濃縮、分裝乳化、保存、使用等工序。臨床使用時(shí)，合格的疫苗必須具備安全、高效、均一、穩(wěn)定的特性。生產(chǎn)過程中采用合理的保存溫度和濃度，有助于延長病毒的保存期和維持較高的抗原水平，對生產(chǎn)中抗原的保存具有重要意義。本文通過對不同毒株熱穩(wěn)定試驗(yàn)、半成品不同溫度、濃度下146S 變化、同時(shí)通過成品疫苗保存期試驗(yàn)及挑戰(zhàn)試驗(yàn)等證明不同的口蹄疫毒株對溫度敏感性不同，半成品、產(chǎn)品疫苗對溫度、酸度比較敏感，2℃～8℃是疫苗最佳保存條件，本文章研究結(jié)果對疫苗穩(wěn)定性方面研究有一定指導(dǎo)作用。

1 材料

1.1 口蹄疫毒株病毒液分別收集培養(yǎng)好的A/WH/09 毒株培養(yǎng)液、O/MYA98 毒株培養(yǎng)液、OR/80 毒株培養(yǎng)液及OZK/93 毒株培養(yǎng)液，各取1000mL 備用。

1.2 口蹄疫半成品原液及濃縮液A/WH/09、O/MYA98 口蹄疫滅活半成品抗原各1000mL，由金宇保靈公司生產(chǎn)部提供。

1.3 口蹄疫成品滅活疫苗OA 型口蹄疫滅活成品疫苗（20瓶）由金宇保靈公司生產(chǎn)部提供。

2 方法

2.1 不同口蹄疫毒株熱穩(wěn)定性試驗(yàn)將A/WH/09 毒株、O/MYA98 毒株、OR/80 毒株及OZK/93 毒株病毒樣品，先進(jìn)行批量解凍，將毒液分裝成10mL 離心管12 只，將不同口蹄疫毒株在90℃熱水浴鍋中滅活1min～8min，檢測TCID50，并記錄數(shù)據(jù)，主要觀察口蹄疫毒株對溫度的敏感性。

2.2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下146S 影響試驗(yàn)隨機(jī)抽取本公司生產(chǎn)部滅活抗原液及其相應(yīng)批號的10倍濃縮純化液，分別取樣進(jìn)行初始樣品146S 含量的測定；將原液樣和10 倍濃縮后樣分別分裝，20mL/瓶，每種樣品分2 組，分別在-20℃和4℃冰箱中保存7 個(gè)月，每月定期各取出1 個(gè)樣品分別進(jìn)行146S 的測定。

2.3 口蹄疫成品滅活疫苗保存期試驗(yàn)及反復(fù)凍融挑戰(zhàn)試驗(yàn)將同批次的20 瓶OA 型口蹄疫滅活成品疫苗分成兩組，一組2℃～8℃保存12 個(gè)月，每月抽檢一瓶；另一組做-20℃挑戰(zhàn)試驗(yàn)，保存8 瓶并反復(fù)凍融5 次，凍融后檢測抗原含量。

3 結(jié)果

3.1 不同口蹄疫毒株熱穩(wěn)定性 從表1 數(shù)據(jù)可知，口蹄疫不同毒株對熱穩(wěn)定性有差異

表1 90℃熱水浴對不同口蹄疫毒株穩(wěn)定性試驗(yàn)（TCID50）

3.2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下146S 影響從表2 數(shù)據(jù)可知，口蹄疫半成品在4℃和-20℃保存的7 個(gè)月中，完整病毒146S 粒子的含量均有所下降。4℃保存條件下，原液樣和濃后樣完整病毒146S 粒子的降解率分別為27.5%、12.3%；-20℃保存條件下，其降解率分別為87.5%、92.4%。從本試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，4℃比-20℃保存條件更有利于抗原的保存，濃度對抗原保存影響不顯著。3.2 口蹄疫成品滅活疫苗保存期試驗(yàn)及反復(fù)凍融挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

表2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下對完整病毒146S檢測結(jié)果（ug/mL）

從圖1 數(shù)據(jù)可知，口蹄疫 A 型、O 型滅活疫苗在2℃～8℃分別放置 12 個(gè)月，每月采用蔗糖密度梯度離心定量法檢測146S 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，146S 抗原含量基本沒有變化,說明疫苗有效抗原保存比較好，完整病毒粒子保存完整。

圖1 口蹄疫成品疫苗2℃～8℃保存12月146S 含量變化（μg/mL）

從圖2 數(shù)據(jù)可知，將口蹄疫滅活疫苗多次冷凍融化后，抗原含量降解比較多，每次反復(fù)凍融抗原損失10～20%左右，5 次反復(fù)凍融后，抗原損失50%左右，因此在保管疫苗時(shí)盡量不要凍融。凍融后的疫苗堅(jiān)決不能使用，因?yàn)橥暾《玖Ｗ?46S 已經(jīng)裂解為無效的12S 五聚體。

圖2 口蹄疫O 型、A 型滅活疫苗反復(fù)凍融后146S 抗原含量變化（μg/mL）

圖3 口蹄疫衣殼蛋白在存儲、加熱、低pH 條件下，完整病毒粒子146S 裂解成12S 五聚體電鏡圖

4 討論

穩(wěn)定的抗原、有效的佐劑是疫苗研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。滅活疫苗在長期儲存、加熱和微酸性環(huán)境中，病毒顆粒極其容易裂解，裂解產(chǎn)物也被稱為12S，12S 是一個(gè)由VP1，VP2，VP3組成的五聚體。因?yàn)槲寰垠w之間存在大量的組氨酸殘基，在酸性環(huán)境下組氨酸會迅速發(fā)生質(zhì)子化，釋放正電荷，通過靜電排斥作用引發(fā)粒子裂解，這是口蹄疫不穩(wěn)定的原因。由于146S 粒子在酸性環(huán)境下分解成12S 粒子，而12S 表面的免疫反應(yīng)位點(diǎn)被隱藏或發(fā)生形變的緣故，使12S 不具備任何免疫原性，無法激發(fā)產(chǎn)生抗體，降低口蹄疫疫苗的免疫效力。口蹄疫病毒會在高溫狀態(tài)下，使組合狀態(tài)的 12S 粒子轉(zhuǎn)化為分解狀態(tài)，因此口蹄疫病毒不宜長期暴露在高溫狀態(tài)下，口蹄疫疫苗效力與口蹄疫滅活疫苗中的 146S 粒子數(shù)量有關(guān)，若是能夠確保 146S 粒子穩(wěn)定不被分解，口蹄疫疫苗的效力就能到有效的保護(hù)，這也是口蹄疫滅活疫苗2℃～8℃保存的機(jī)理。口蹄疫抗原穩(wěn)定性差給口蹄疫疫苗的生產(chǎn)、儲存和應(yīng)用帶來了很多困難，使用過程中必須全程冷鏈運(yùn)輸以保護(hù)口蹄疫的免疫原性。

口蹄疫病毒抗原對酸和熱極其敏感，為了保證疫苗質(zhì)量，生產(chǎn)商采取研發(fā)疫苗抗原保護(hù)劑、增加昂貴的冷鏈運(yùn)輸系統(tǒng)、將優(yōu)質(zhì)疫苗送到用戶手中。如何保障疫苗抗原不降解或降解速率慢，是疫苗生產(chǎn)企業(yè)的難點(diǎn)，但金宇生物一直采用自主研發(fā)的UTM 保護(hù)劑，從工藝技術(shù)上保障疫苗穩(wěn)定性，從運(yùn)輸環(huán)節(jié)上采用無死角的2℃～8℃冷鏈運(yùn)輸，使客戶用上最好、最新鮮的疫苗。不論后續(xù)技術(shù)如何革新，口蹄疫病毒粒子的完整性和穩(wěn)定性研究，一直是廣大科技從業(yè)者長期努力和研究的方向。