參附注射液保護(hù)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟的作用機(jī)制

胡嗣欽，王兵，陳林，肖平

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.南寧市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530001）

0 引言

創(chuàng)傷是40 歲以下人群最主要的死亡原因之一，全球每年約有10%的死亡病例和16%的傷殘病例由床上導(dǎo)致[1]。嚴(yán)重創(chuàng)傷后，患者體內(nèi)的有效循環(huán)血量減少，導(dǎo)致組織灌溉不足，細(xì)胞代謝紊亂，最終損害包括肝臟在內(nèi)的多種器官，嚴(yán)重影響了患者的生存。參附注射液的主要成分為人參皂苷和烏頭類(lèi)生物堿，近來(lái)來(lái)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，參附注射液通過(guò)改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂，直接或間接減輕器官功能的損害，減少白細(xì)胞嵌頓和激活、抑制炎癥因子、減弱細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)等[2]。IKK-β 和TNF-α 是最常見(jiàn)的炎癥因子之一，參與由細(xì)胞內(nèi)各種的免疫反應(yīng)。據(jù)此，通過(guò)對(duì)Wistar 大鼠構(gòu)建創(chuàng)傷嗜血性休克模型，探究參附注射液的作用機(jī)制，為臨床中治療創(chuàng)傷后失血性休克提供重要研究思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí) Wistar 雄 性 大 鼠50 只，體 重 在180g-220g 左右，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證SCXK（湘）2014-0011）。適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后隨機(jī)分為5 組，每組10 只，每只動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院分子實(shí)驗(yàn)中心，室內(nèi)溫度控制在23℃-25℃，相對(duì)濕度保持在45%-60%，適應(yīng)性常規(guī)喂養(yǎng)一周后開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)造模。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

參附注射液:10mL/支（雅安三九藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020664）；0.9%氯化鈉注射液：250mL/瓶（廣西裕源藥業(yè)有限公司，國(guó)字準(zhǔn)藥H45020976）

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

總RNA 提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）（code：RR9767，日 本 TaKaRa 公 司）；逆 轉(zhuǎn)錄試劑盒 （PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time））（code：RR047A，日 本 TaKaRa 公 司）；熒光定量 PCR 反應(yīng)試劑盒 SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNase HPlus）（code：RR820A，日 本TaKaRa 公 司)；大 鼠ELISA Kit 試劑盒（code：JYM0729Ra、JYM0646Ra，武漢基因美生物科技有限公司）

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Centrifuge 5810R；全自動(dòng)染色儀器DAKEWE； 病理石蠟包埋機(jī)TMA81010100；倒置顯微 鏡CKX41；PCR 擴(kuò) 增 儀TaKaRa TP-600 型；熒 光 定 量PCR 儀ABI-7500；紫外分光光度計(jì)島津2000；超低溫冰箱EXF40086V；超凈工作臺(tái)SW-CJ-IFD；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模及干預(yù)方法

將50 只SPF 級(jí)Wistar 雄性大鼠隨機(jī)分為5 組，每組10只，即正常組（N 組）、模型組（M 組）、參附注射液低劑量組（D組）、參附注射液低劑量組（Z 組）、參附注射液低劑量組（G組）。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，N 組予常規(guī)飼養(yǎng)；

M 組、D 組、Z 組、G 組大鼠經(jīng)3% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（1mL/kg）后置于37%恒溫操作臺(tái)，折斷雙側(cè)股骨中段。分離大鼠股動(dòng)脈及股靜脈，股動(dòng)脈置管連接壓力監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)血壓；同時(shí)，使放血和輸液穩(wěn)定血壓水平。手術(shù)完畢穩(wěn)定10min 開(kāi)始放血，10min 內(nèi)使大鼠平均動(dòng)脈壓維持在40mmHg（1mmHg=0.133 kPa）左右。隨后M 組、D 組、Z 組、G 組于造模后0h、2h 進(jìn)行2 次藥物干預(yù)，分別予10mL/kg 生理鹽水、5mL/kg 參附注射液、10mL/kg 參附注射液、20mL/kg參附注射液。

1.2.2 標(biāo)本的采集

藥物干預(yù)2h（造模4h），用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（1mL/kg）麻醉后，剪取大鼠劍突下腹白線正中橫行2cm 作用手術(shù)切口，找到肝臟，剪取大小約為0.5cm×0.5cm×0.5cm肝臟組織2 塊存放于液氮罐中備用以行ELISA 和 RT-PCR檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 肝臟ELISA 檢測(cè)

根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，將肝臟研磨均漿后，離心20分鐘（每分鐘轉(zhuǎn)速：3500 轉(zhuǎn)/分，離心半徑：9.5cm）。在酶標(biāo)包被板上稀釋與加樣，加酶。溫育棄液后，加入洗滌液，靜置30秒棄去，重復(fù)5 次。分別加入顯色液A 和B。ELISA 檢測(cè)儀以空白孔調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）來(lái)測(cè)定IKK-β、TNF-α 蛋白的表達(dá)。

1.3.2 肝臟組織PCR 檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大鼠總 RNA，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)試提取液濃度后在普通梯度儀上逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩T-PCR 儀系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 mRNA 表達(dá)量。引物參照NCBI 中的基因序列設(shè)計(jì)，由生工生物股份有限公司代替合成IKK-β、TNF-α 及內(nèi)參基因β-actin，包含2 個(gè)外顯子的序列。合成引物見(jiàn)表 1。

表1 PCR 引物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，蛋白和mRNA 表達(dá)量為計(jì)量資料，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD檢測(cè)，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IKK-β、TNF-α 蛋白ELISA 檢測(cè)結(jié)果

對(duì)ELISA 吸光度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表2），5 組大鼠IKK-β、TNF-α 蛋白水平表達(dá)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與正常組相比較，模型組和三種參附注射液組的IKK-β、TNF-α蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（★★P<0.01），與模型組相比較，三種參附注射液組的IKK-β、TNF-α 蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（▲▲P<0.01）。

表2 血清中IKK-β、TNF-α 蛋白的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)（±s）

表2 血清中IKK-β、TNF-α 蛋白的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)（±s）

注：與N 組相比較，★★P<0.01；與M 組相比較，▲▲P<0.01；

分組 IKK-β TNF-α N 52.11±1.51 23.72±0.52 M 85.42±2.45★★ 68.41±0.87★★68.22±0.41★★▲▲ 57.43±1.21★★▲▲Z 63.01±0.56★★▲▲ 45.71±1.33★★▲▲G 59.86±1.23★★▲▲ 31.02±1.58★★▲▲P 值 <0.001 <0.001 D

2.2 IKK-β、TNF-α mRNA 水平RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

檢 測(cè) 各 組 大 鼠IKK-β、TNF-α mRNA 水 平（表3），采用與內(nèi)參基因 β-actin mRNA 對(duì)比 2-△△Ct法統(tǒng)計(jì)。5 組大 鼠IKK-β、TNF-α mRNA 表 達(dá) 總 體 差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意義（P<0.01）；與正常組相比較，模型組和對(duì)照組的IKK-β、TNF-α mRNA 表達(dá)差異均明顯增高（★★P<0.01）；與模型組相比較，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的IL-6、IL-8、TNF-α 和NF-κB mRNA 表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（▲▲P<0.01）；與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組的ⅡKK-β、TNF-α mRNA 達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(☆☆P<0.01)；

表3 各組大鼠轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 mRNA 表達(dá)量統(tǒng)計(jì)（±s）

表3 各組大鼠轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 mRNA 表達(dá)量統(tǒng)計(jì)（±s）

注：與N 組相比較，★★P<0.01；與M 組相比較，▲▲P<0.01；

分組 IKK-β TNF-α N 1.00±0.25 1.00±0.18 M 1.78±0.37★★ 1.58±0.37★★1.54±0.45★★▲▲ 1.41±0.86★★▲▲Z 1.32±0.27★★▲▲ 1.32±0.21★★▲▲G 1.12±0.57★★▲▲ 1.21±0.25★★▲▲P 值 <0.001 <0.001 D

3 討論

創(chuàng)傷失血性休克患者會(huì)出現(xiàn)明顯的血流動(dòng)力學(xué)異常，當(dāng)有效循環(huán)血量減少，導(dǎo)致組織灌溉不足，細(xì)胞代謝紊亂，多種細(xì)胞因子、黏附分子表達(dá)或釋放從而導(dǎo)致腸黏膜屏障受損，內(nèi)毒素通過(guò)門(mén)靜脈入肝，最終形成肝臟的衰竭[3-4]。肝臟枯否氏細(xì)胞(KC)是細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的主要來(lái)源，通過(guò)NF-kb 信號(hào)通路能分泌TNF-α 等細(xì)胞因子參與全身及肝臟局部的炎癥反應(yīng)，在失血性休克繼發(fā)的肝臟局部和全身的組織損害中扮演重要角色[5-6]。IKK-β 作為NF-kb 信號(hào)通路啟動(dòng)因子之一，是 NF-KB 的活化和移位的前提。所以在失血性休克后，與正常組相比較，模型組和對(duì)照組的IKK-β、TNF-α mRNA表達(dá)差異均明顯增高，這是由于休克導(dǎo)致內(nèi)毒素釋放IKK-β，激活NF-kb 信號(hào)通路能分泌TNF-α。

參附注射液源于《濟(jì)生方》中的參附湯，有回陽(yáng)救逆、益氣固脫的作用，是現(xiàn)代制藥工業(yè)從紅參和黑附片中提取其有效成分人參皂苷和烏頭類(lèi)生物堿而成。藥理學(xué)研究表明，人參皂苷可以擴(kuò)張管狀動(dòng)脈，降低心肌耗氧量，有減輕心肌缺血，改善微循環(huán)，穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)的作用[7]；烏頭類(lèi)生物堿能興奮α、β 受體，增強(qiáng)心肌收縮力，提高心輸出量[8]。研究表明，參附注射液對(duì)血流動(dòng)力學(xué)有明顯的改善作用，能夠有效的緩解血管內(nèi)皮損傷，緩解高凝狀態(tài)，促進(jìn)休克后期凝血功能的恢復(fù)[9]。本研究結(jié)果顯示,與模型組相比較，三組參附注射液的IKK-β、TNF-α 蛋白和mRNA 水平基因表達(dá)量均顯著下降。與正常組相比較，高濃度的參附注射液組的IKK-β、TNF-α蛋白表達(dá)量和mRNA 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正因?yàn)檠装Y因子釋放的降低，改變了肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，使肝細(xì)胞病理狀態(tài)趨于正常肝細(xì)胞的狀態(tài)。因此，我們可以推斷測(cè)參附注射液通過(guò)抑制IKK-β、TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)，緩解血管內(nèi)皮損傷，緩解高凝狀態(tài)，從而改善和保護(hù)肝臟功能的完整性。

綜上所述，參附注射液通過(guò)調(diào)控炎癥因子的釋放，緩解血管內(nèi)皮損傷，從而改善和保護(hù)肝臟功能在創(chuàng)傷失血性休克中功能和形態(tài)的完整性。