NRXN1 和MECP2 基因擴(kuò)增特異性引物設(shè)計(jì)及其在兒童孤獨(dú)癥檢測(cè)中的應(yīng)用

李勝，費(fèi)安興，李穎，謝芳，江鴻通信作者)

（鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市婦幼保健院/湖北理工學(xué)院附屬婦幼保健院（兒童醫(yī)院），湖北 黃石 435000）

0 引言

兒童孤獨(dú)癥譜系障礙由多種致病基因?qū)е?，通過全基因組檢測(cè)方法應(yīng)用于孤獨(dú)癥患兒的臨床檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25 ～35%的遺傳因素與孤獨(dú)癥發(fā)病密切相關(guān)，基因-環(huán)境共同影響孤獨(dú)癥臨床表現(xiàn)。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)可能會(huì)增加罹患復(fù)雜多基因疾病的風(fēng)險(xiǎn)。NRXN1 基因編碼的突觸細(xì)胞粘附分子是神經(jīng)系統(tǒng)重要的功能蛋白，參與了突觸基因轉(zhuǎn)錄翻譯通路、泛素化通路、蛋白質(zhì)合成和降解，影響神經(jīng)元的發(fā)育、形成和功能。MECP2 基因編碼的MeCP2 蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，也調(diào)控神經(jīng)元中許多基因的表達(dá)。雖然已經(jīng)了解NRXN1 基因和MECP2 基因在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要功能，但在孤獨(dú)癥譜系障礙疾病中的分子診斷尚未開展。本研究過檢測(cè)NRXN1基因和MECP2 基因SNP 位點(diǎn)多態(tài)性與自閉癥臨床表現(xiàn)關(guān)聯(lián)分析，建立孤獨(dú)癥譜系障礙的診斷方法。

1 資料與方法

1.1 受試者招募

受試者包括確診為孤獨(dú)癥譜系障礙兒童及正常健康組兒童，所有確診孤獨(dú)癥患兒均符合ASD 診斷指南[1]，為2019 年7 月至2020 年7 月在我院就診的患者，受試者不區(qū)分男女性別。對(duì)照組受試者同樣被告知該研究的目的、意義，獲取血液樣本的流程等，在獲取患者同意后簽署知情同意。

1.2 血樣的獲取及運(yùn)輸

患者簽署知情同意書后，由主管醫(yī)生同負(fù)責(zé)護(hù)士聯(lián)系，在患者抽血用于血常規(guī)、血生化等檢驗(yàn)項(xiàng)目時(shí)，多獲取2mL 靜脈全血用于抽提DNA 及后續(xù)研究。抽取該2mL 血樣時(shí)使用含EDTA 抗凝的紫色帽采血管，輕搖混勻并記錄患者住院號(hào)等相關(guān)信息以資鑒別。血樣釆集成功后，盡快(6h 內(nèi))置于-20℃冰箱冷凍保存。定期由相關(guān)人員將凍存血樣送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行深低溫(-80°C) 保存或DNA 提取，運(yùn)輸途中使用干冰或干冰袋保持低溫，以防止血樣因溫度變化造成反復(fù)凍融而影響DNA 質(zhì)量。

1.3 DNA 抽提、定量和純度測(cè)定

DNA 提取采用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組DNA 提取試劑盒(離心柱型，目錄號(hào):DP318-02)，由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。具體步驟如下：（1）取血液標(biāo)本5-10mL，3000rpm 離心15min，小心丟棄上清，保留沉淀。（2）向沉淀物中，加入180μL 的緩沖液GA，重新徹底懸起。（3）加入200μL 蛋白酶K 溶液，輕輕顛倒混勻，56℃孵育10min。（4）加入200μL 的緩沖液GB，輕輕顛倒混勻，70℃孵育10min，至溶液徹底澄清，瞬離。（5）加入200μL的無水乙醇輕輕顛倒混勻樣本，室溫放置5min，瞬離。（1）取上一步所得溶液添加到一個(gè)吸附柱CR 中（吸附柱放入收集管中），12000rpm 離心30s，棄廢液，將吸附柱CR 放回收集管中。（7）向吸附柱CR 中加入500μL 緩沖液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否加入無水乙醇），12000rpm 離心30s，棄廢液，將吸附柱CR 放回收集管中。（8）向吸附柱CR 中加入700μL漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否加入無水乙醇），12000rpm離心30s，棄廢液，將吸附柱CR 放回收集管中。（9）向吸附柱CR 中加入500μL 漂洗液PW，12000rpm 離心30s，棄廢液。（10）將吸附柱CR 放回廢液收集管中，12000rpm 離心2-5min，盡量除去漂洗液。（11）將吸附柱CR 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，加入50μL 洗脫緩沖液TB，室溫靜置2-5min，12000rpm 離心2min 收集DNA。使用ABI 公司Qubit 3.0 熒光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度，DNA 濃度測(cè)定按照199:1 配置稀釋液，將稀釋好的DNA 溶液上機(jī)檢測(cè)。

1.4 引物設(shè)計(jì)和PCR 檢測(cè)

分別設(shè)計(jì)NRXN1 基因的1 條引物、MECP2 基因的2 條引物，采用血液基因組模板進(jìn)行PCR 和電泳，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，10min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，30s;72℃，15min，35 個(gè)循環(huán)；4℃，終止。

1.5 數(shù)據(jù)分析

基因檢索使用NCBI 基因檢索數(shù)據(jù)庫；引物設(shè)計(jì)采用NCBI-Blast 比對(duì)，使用Primer 軟件進(jìn)行引物在線設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)

根 據(jù)NCBI 上NRXN1 基 因 和MECP2 基 因 序 列 號(hào)分 別 是NM_001135659.3 和NM_001110792.2, 結(jié) 合 引物設(shè)計(jì)原則考慮GC 含量，堿基互補(bǔ)和退火溫度等條件，設(shè) 計(jì) 一 條NRXN1 基 因 引 物 為：Forwardprimer:5’-ATGACAGAAGAAGCAGGCCT-3’，Reverseprimer:5’-AAGTACAGGAAGCCAGCAGT-3’;MECP2 基 因2 條 引 物分別 為：Forwardprimer:5’-ATGATGCTCTTTCCCACCCA-3’，R e v e r s e p r i m e r:5’-C C T T T T G C A C T C C A C T G T C C-3’;Forwardprimer:5’-TTGTTTCTCCCGTGCTTGTG-3’，Reverseprimer:5’-AACACACTCGGACCCTACTG-3’。

2.2 PCR 擴(kuò)增測(cè)序分析結(jié)果

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger 測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析結(jié)果顯示，如圖1 所示，分別是1 條NRXN1 基因的特異性片段，和2 條MECP2 基因特異性片段。由此說明，設(shè)計(jì)得到的1 條NRXN1 基因引物和2 條MECP2 基因引物均具有特異性，可用于PCR 檢測(cè)。

圖1 NRXN1 基因（A）和MECP2 基因（B 和C）PCR 擴(kuò)增基因片段同源性比對(duì)分析結(jié)果

3 討論

自閉癥譜系障礙(ASD)是一組異質(zhì)性的神經(jīng)發(fā)育障礙，其特征是社會(huì)交往和溝通方面的問題以及重復(fù)和刻板行為的存在[2]。據(jù)估計(jì)，ASD 在普通人群中的患病率為1%-2%，平均男女比例為4-5:1。雖然ASD 具有復(fù)雜的多因素病因?qū)W，但雙胞胎研究證實(shí)了其強(qiáng)大的遺傳作用。單卵雙生兒孤獨(dú)癥的符合率為70%-90%，雙卵雙生兒孤獨(dú)癥的符合率高達(dá)30%，在兄弟姐妹中占3%-19%。此外，同父同母兄弟姐妹之間的一致性比同父異母兄弟姐妹之間的一致性高兩倍，這為遺傳因素在ASD 的發(fā)展中起重要作用提供了證據(jù)[3]。多項(xiàng)研究證實(shí)了罕見的新生拷貝數(shù)變異(CNVs)對(duì)自閉癥譜系障礙(ASD)風(fēng)險(xiǎn)的影響[4]。此外，約31%的ASD 患者還存在智力障礙(ID)，20%-37%的人患有癲癇，此外，癲癇性腦電圖異常往往可在自閉癥兒童中發(fā)現(xiàn)，即使沒有癲癇發(fā)作，患有ASD 的兒童經(jīng)常出現(xiàn)其他精神和醫(yī)療狀況，包括焦慮癥、抑郁癥、注意力缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)、睡眠障礙和胃腸問題。約75%的ASD 患者被診斷為原發(fā)性自閉癥譜系障礙，這種類型ASD 的患病率約為35%的兄弟姐妹和約20%的病例有ASD 陽性家族史[5]。

研究表明，一些重要候選基因是影響ASD 癥狀的關(guān)鍵因子[6]?；蛭稽c(diǎn)突變和CNVs 提示這些基因編碼的蛋白在染色質(zhì)重構(gòu)(CHD8, BAF155)、突觸細(xì)胞粘附分子(Neurexin 和Neuroligin 家族，CNTN4)、神經(jīng)遞質(zhì)、突觸支架蛋白(SHANK2和SHANK3)、離子通道蛋白(CACNA1A, CACNA1H, SCN1A,SCN2A)發(fā)揮重要作用。這些蛋白還參與與突觸基因轉(zhuǎn)錄翻譯通路(FMR1、TSC1、TSC2、PTEN、NF1、CYF1P1)、泛素化通路(UBE3A、PARK2、TRIM33)、蛋白質(zhì)合成和降解相關(guān)的信號(hào)通路和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，參與突觸和神經(jīng)元的發(fā)育、形成和功能[7-9]。染色質(zhì)重構(gòu)調(diào)控基因表達(dá)，可能影響神經(jīng)元的形成和分化。MeCP2 蛋白(甲基CPG 結(jié)合蛋白2)是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控神經(jīng)元中許多基因的表達(dá)[10]。本研究通過NRXN1 基因和MECP2基因引物設(shè)計(jì)，在前期入組的孤獨(dú)癥確診患兒血液基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，我們所設(shè)計(jì)的三條引物均具有特異性，可以應(yīng)用于PCR 檢測(cè)；通過NRXN1 基因和MECP2 基因PCR 擴(kuò)增特異性引物設(shè)計(jì)，為進(jìn)一步進(jìn)行基因位點(diǎn)SNP 測(cè)序與自閉癥臨床表現(xiàn)關(guān)聯(lián)分析具有重要意義，也具有良好的應(yīng)用前景。