SiRNA 沉默LRP-5 對胃癌細胞MGC-803 差異蛋白質(zhì)組的影響

趙陽，鄧秀玲，武瑞兵，王海生

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

0 引言

胃癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率和死亡率在癌癥中排名第二[1]。半數(shù)以上的發(fā)患者群集中在東南亞地區(qū)，這些國家的死亡率高于其他國家[2]。目前對于早期胃癌患者行根治性治療即手術(shù)后進行化療，術(shù)后隨訪5 年生存率90%[3-4]。胃癌的發(fā)病機制是一種多步驟、多因素的綜合性疾病。

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-5(LRP-5 蛋白)是低密度脂蛋白受體家族中的一員，在許多組織中高表達，參與調(diào)節(jié)骨發(fā)育，膽固醇代謝以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-7]。LRP-5 屬于單次跨膜結(jié)構(gòu)的受體蛋白,對Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。Wnt 蛋白通過與卷曲蛋白(Fz)家族的7 個跨膜受體以及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP) 5 和6 的成員結(jié)合，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8-10]。前期已有研究證實LRP-5 與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對其作用機制及靶點進行預(yù)測，旨為之后LRP-5 抗胃癌分子機制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)染無關(guān)序列細胞、轉(zhuǎn)染LRP-5 基因sh'RNA 質(zhì)粒來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室。過硫酸銨購自sigma 公司。IPG Buffer pH3-10 NL、ImmobilineTM DryStrip 購 自GE 公司。非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（SK3071）、溴酚藍、2D Equilibration Buffer（SD6030）、2D 電泳樣品提取緩沖液系列、瓊脂糖封膠液（0.5%低熔點瓊脂糖+電泳緩沖液）均購自上海生工公司。乙腈和基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、乙腈（ACN）購自Gibco 公司。臺式高速離心機購自上海醫(yī)療器械有限公司

1.2 各細胞總蛋白質(zhì)的提取

1.2.1 樣品制備

收集兩組處理過的胃癌MGC-803 細胞，分別加入含PMSF 的RIPA 裂解液，充分混合均勻。在80-100W、2S 下超聲3min,之后在 4℃、12000rpm 的離心機離心30min。收集上清到EP 管中，將適量提前遇冷的丙酮加入含上清的EP 管中，-20℃過夜，次日離心30min，棄上清，在沉淀中加入一定量PL039 蛋白裂解液。

1.2.2 蛋白質(zhì)定量

取12 只1.5mLEP 管，將不同梯度體積的蛋白質(zhì)標準品加入EP 管，重復(fù)兩次，在每個EP 管中加入0.5mL 沉淀劑I, 渦旋30S，靜置2-3min, 之后加入0.5mL 沉淀劑Ⅱ，渦旋30s,12000rpm 離心5min, 棄上清，加入100ul 銅試劑、400ul ddH2O，渦旋30S，之后加入1mL 生色試劑混合液，常溫下靜置15-20min，480nm 波長下測量OD 值，根據(jù)標準曲線計算蛋白質(zhì)含量。

1.3 蛋白質(zhì)雙向電泳

1.3.1 等電點聚焦電泳（第一向）

蛋白上樣量為 150μg，選用pH3-10 NL IPG 預(yù)制干膠條，進行第一向等電聚焦電泳，電泳參數(shù)及條件如下：（表 1）。

表1 等電點聚焦電泳參數(shù)

將聚焦的膠條加入10mL 的2D 平衡緩沖液（加入1%二硫蘇糖醇），搖15min。之后加入2D 平衡緩沖液（2.5%碘乙酰胺）清洗，搖15min。

1.3.2 SDS-PAGE（第二方向）

膠條置于凝膠板中并加入低熔點瓊脂糖封膠液。室溫放置20min 后開始電泳，電泳45min，200V /膠，當溴酚藍移動到距離凝膠下沿0.5cm 取出凝膠進行染色。

1.3.3 凝膠染色

凝膠固定2h，用考馬斯亮藍染色12h，之后水洗染料。

1.3.4 凝膠圖掃描

以300dpi 的分辨率掃描漂洗的PAGE 凝膠。使用PDquest 8.0 軟件分析圖像。

1.4 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定

1.4.1 脫色冷凍

將顆粒切碎置于EP 管中。添加200-400μL 乙腈使管中顆粒脫色。冷凍干燥，加入5μL 測序級胰蛋白酶溶液，37℃下反應(yīng)約20h。吸出酶水解產(chǎn)物并轉(zhuǎn)移到新的EP 管中進行凍干。

1.4.2 MALDI-TOF-TOF

取凍干樣品2μL，加入乙腈重新配制樣品，取1μL 樣品加到樣品靶上，自然風(fēng)干。將0.5μL 過飽和CHCA 基質(zhì)溶液點到相應(yīng)的目標位置，自然干燥，樣品靶用氮氣吹掃，放入儀器進靶槽。質(zhì)譜分析采用自動采集數(shù)據(jù)模式和正離子采集數(shù)據(jù)，PMF 質(zhì)量掃描范圍為800～4000Da，之后選用母離子信噪比大于50 的離子進行二次質(zhì)譜分析。

1.4.3 數(shù)據(jù)庫選擇

該試驗檢索了Mascot 數(shù)據(jù)庫，該蛋白質(zhì)鑒定檢索軟件使用廣泛，能將質(zhì)譜數(shù)據(jù)識別為蛋白質(zhì)。

1.5 觀察指標

用雙向電泳及差異點軟件分析兩組蛋白質(zhì)差異點，蛋白質(zhì)質(zhì)譜對部分差異點進行質(zhì)譜鑒定。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)定量(圖1)

圖1 蛋白質(zhì)定量標準曲線

兩組實驗樣品蛋白質(zhì)測定的濃度分別為：L68：10.83μg/μL；NC：11.88μg/μl。

2.2 2D 電泳實驗結(jié)果

由左到右為等點聚焦電泳，由下到上為 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜（圖2）。

圖2 蛋白質(zhì)2D 電泳

2.3 差異點分析

利用 PDQuest 軟件分析2D 電泳膠圖，尋找蛋白表達差異點。結(jié)果如圖3：

圖3 各實驗組蛋白質(zhì)差異點

經(jīng)過雙向電泳和PDQuest 軟件分析，發(fā)現(xiàn)實驗組與陰性對照組組兩組間蛋白質(zhì)灰度值大于2 倍以上的一共有 29個點，在這項研究中，采取了15 種蛋白質(zhì)差異點進行質(zhì)譜分析。

2.4 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定

通過灰度值差異進行選擇，在29 個灰度值差異大于2 倍的蛋白質(zhì)點中，選擇15 個點進行質(zhì)譜鑒定，12 個成功。與無關(guān)序列組相比，干擾組中10 個點上調(diào)，2 個點下調(diào)。這些蛋白質(zhì)包括：細胞骨架，細胞周期，分子伴侶，細胞增殖和糖代謝相關(guān)蛋白。如表2：

表2 經(jīng) MALDI-TOF-TOF 鑒定的 12 個差異蛋白質(zhì)點

3 討論

已有文獻報道LRP-5 蛋白含量在胃癌組織中明顯高于其他正常組織，通過基因沉默其表達可抑制胃癌MGC-803 細胞的侵襲和遷移能力。前期多集中在對單個蛋白表達的研究，對于LRP-5 相關(guān)的所有蛋白表達情況尚不清楚。

本研究從蛋白質(zhì)組的角度出發(fā)，研究沉默LRP-5 蛋白后胃癌MGC-803 細胞中整體蛋白質(zhì)的變化情況。本研究采用雙向電泳對蛋白質(zhì)進行分離，蛋白質(zhì)譜對其分析鑒定，研究發(fā)現(xiàn)共有15 個差異蛋白點，成功鑒定12 個，其中表達量上調(diào)的蛋白10 個，下調(diào)的蛋白2 個。上調(diào)的蛋白包括FSCN1、EZRI、EF2、TRAP1、HSP90α、NPM、DJB11、TRXR1、GAPD、ATPA，下調(diào)的蛋白包括PGK1，NDKB。

篩選出的蛋白質(zhì)主要在葡萄糖代謝、細胞侵襲遷移、細胞周期等方面發(fā)揮作用。硫氧還蛋白還原酶(TrxR)是Trx 系統(tǒng)的重要組成部分，在調(diào)節(jié)多種細胞氧化還原信號通路中起著關(guān)鍵作用[11]。雷洪等研究發(fā)現(xiàn)人硫氧還蛋白還原酶（TrxR）促進活性氧(ROS)的產(chǎn)生從而抑制肝癌細胞的生長并誘導(dǎo)凋亡，并伴隨絲裂原相關(guān)蛋白激酶通路的激活[12]。許多腫瘤細胞的TrxR 水平升高[13-14]。李楠等[15]研究發(fā)現(xiàn)Ezrin 蛋白在乳腺癌組織中表達上調(diào)，其在體內(nèi)外均能促進乳腺癌的增殖、遷移、侵襲和血管生成。

綜上所述，以上兩種蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，因此本研究以LRP-5 作為切入點，篩選出的12 個蛋白點可用作調(diào)節(jié)胃癌發(fā)生發(fā)展的靶點，本研究采用的細胞種類單一，對差異的蛋白未進行進一步證實，通過本研究初步探索的作用靶點為治療胃癌的發(fā)生發(fā)展提供新的思路和理論基礎(chǔ)。