MMP-2 及TIMP-2 在稽留流產(chǎn)絨毛組織中的表達(dá)及意義

焦雪娟通信作者，余文華

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 蚌埠 233000)

0 引言

稽留流產(chǎn)，可稱之為過期流產(chǎn)，其含義為胎兒在死亡一段時(shí)間內(nèi)不能被正常排出體外，仍然滯留在宮腔內(nèi)。引發(fā)稽留流產(chǎn)的因素有很多，其發(fā)病率也極高，其中包括的因素有遺傳基因異常、生殖器官有異、生殖器官感染、內(nèi)分泌失調(diào)以及外界環(huán)境因素，另外還有大約60%-70%的個(gè)體其患病原因尚不明確。子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵組成成份包括層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原，當(dāng)胚胎植入以及受精卵著床的時(shí)候，則需要將其進(jìn)行降解。關(guān)于調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)上膠原的合成，則是由兩組酶及其抑制因子進(jìn)行，分別是基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子,半胱氨酸組織蛋白酶和半胱氨酸組織蛋白酶抑制因子。

本研究擬搜集稽留流產(chǎn)婦女（16 例）和正常早孕婦女（21例）的絨毛組織，通過Western-blot 檢測MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）和TIMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-2）在絨毛組織中的表達(dá)，研究稽留流產(chǎn)與MMP-2 及TIMP-2 的相關(guān)性，進(jìn)一步查找稽留流產(chǎn)的具體的病因，這給以后對稽留流產(chǎn)進(jìn)行治本療法提供了條件。

1 資料與方法

1.1 一般資料

時(shí)間跨度控制在2019 年11 月至2020 年11 月期間，選取在我院婦產(chǎn)科門診就診的稽留流產(chǎn)患者16 例，年齡24～44歲，停經(jīng)時(shí)間42～85 天。選擇同期就診我院婦產(chǎn)科門診要求終止妊娠的21 例正常早孕婦女作為正常對照組，年齡17～43歲，停經(jīng)時(shí)間42～63 天。兩組年齡、停經(jīng)時(shí)間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)組個(gè)體標(biāo)準(zhǔn)：（1）個(gè)體確診為稽留流產(chǎn)；（2）經(jīng)胚胎染色體測試，夫妻皆無異常；（3）經(jīng)白帶及超聲檢查，個(gè)體無生殖器官異常和被感染現(xiàn)象；（4）男方精液無異；（5）個(gè)體體內(nèi)抗體呈陰性，包括抗甲狀腺球蛋白、抗核酸抗原、抗心磷脂這些抗體；另有停經(jīng)史以及陰道無血或陰道有少量血的臨床癥狀，宮內(nèi)妊娠經(jīng)彩超檢測，呈無胚芽現(xiàn)象或者無心管搏動(dòng)現(xiàn)象。對照組個(gè)體標(biāo)準(zhǔn)：正常妊娠但在懷孕12 周內(nèi)進(jìn)行人工流產(chǎn)的個(gè)體，無自然流產(chǎn)病史，此次妊娠陰道臨床癥狀表現(xiàn)正常；胚胎經(jīng)彩超檢測為正常，呈有胚芽現(xiàn)象以及有心管搏動(dòng)現(xiàn)象。

1.3 Western blot 檢測MMP-2、TIMP-2 蛋白表達(dá)

無菌操作下收集人工流產(chǎn)時(shí)取出的絨毛，用PBS 漂洗去除血污后，通過冷PBS 進(jìn)行流動(dòng)性洗滌，將已經(jīng)預(yù)冷過的細(xì)胞裂解液取出，對細(xì)胞進(jìn)行裂解，最后把總蛋白提取出來，且實(shí)行蛋白定量，將總含量為25μL 的細(xì)胞總蛋白與上樣緩沖液進(jìn)行變性，而后通過10%聚丙烯酰胺凝膠來進(jìn)行電泳分離，最后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜中；把硝酸纖維素膜放在5%脫脂奶粉中，室內(nèi)溫度下密閉2h；另外將兔抗人MMP-2、TIMP-2 一抗（1:300）置于4°C 中過夜；已經(jīng)添加了辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:1000）置于37°C 中2h，添入化學(xué)發(fā)光底物常規(guī)顯影，將β-actin 作為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 確定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組絨毛組織中MMP-2、TIMP-2 蛋白表達(dá)水平

與正常終止妊娠患者相比，患有稽留流產(chǎn)個(gè)體體內(nèi)的MMP-2 蛋白表達(dá)水平以及TIMP-2 蛋白表達(dá)水平都顯著下調(diào)（***P<0.01,**P<0.1）。見圖（1-6）及表（1,2）。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 MMP-2 和TIMP-2 在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達(dá)

圖2 MMP-2 和TIMP-2 在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達(dá)

圖3 MMP-2 和TIMP-2 在正常終止妊娠絨毛組織中的表達(dá)

圖4 MMP-2 和TIMP-2 在正常終止妊娠絨毛組織中的表達(dá)

圖5 MMP-2 和TIMP-2 在正常終止妊娠絨毛組織中的表達(dá)

圖6 MMP-2 和TIMP-2 在不同患者絨毛組織中的表達(dá)量的差異

表1 MMP-2 t 檢驗(yàn)

表2 TIMP-2 t 檢驗(yàn)

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），其屬于鋅離子依賴性蛋白酶，一般情況下，都是呈非活性酶原狀態(tài)而滲出細(xì)胞外的，現(xiàn)如今起碼已經(jīng)有18 種MMP 被發(fā)現(xiàn)了，它們共同組成了MMPs超家族，MMPs 超家族中最關(guān)鍵的MMP 之一是Ⅳ型膠原酶，其可由兩個(gè)亞型組成，分別是MMP-2（72KD 型，明膠酶A）以及MMP-9（92KD 型明膠酶B），Ⅳ型膠原和彈力纖維是MMP-2 和MMP-9 的關(guān)鍵作用底物，另外還含有消融明膠的特點(diǎn)?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制物(tiSSueinhibitorsofmet alloproteinases,TIMPs) 能夠阻礙MMPs 進(jìn)行活化。按照各類TIMPs 出現(xiàn)的時(shí)間次序進(jìn)行定名，分別稱之為TIMP-1，TIMP-2，還有TIMP-3 和TIMP-4，不管是活化的MMP-2 還是非活性的MMP-2，TIMP-2 都能夠跟它進(jìn)行聯(lián)結(jié)，最終得到比例為1:1 的化學(xué)復(fù)合物，并且MMP-2 會(huì)因此沒了活性，也就沒了破壞膠原的能力[4,5]。在細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解的時(shí)候，MMPs 與TIMP 之間所維持的動(dòng)態(tài)平衡在其中有極大的影響。

不管是胚胎植入還是受精卵著床的時(shí)候，子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)都需要被降解，此過程類似于惡性腫瘤的生物學(xué)行為，層粘連蛋白、纖連蛋白以及膠原共同組成了子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵部分。在滋養(yǎng)細(xì)胞達(dá)成掠奪的途中，子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)(ExtraeellularMatrix，ECM)的降解在其中有著十分關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Niu[6]等研究結(jié)果顯示：有活性的MMP-2在妊娠早期由絨毛組織泌出，隨著胎盤的生長發(fā)育，在妊娠整個(gè)時(shí)期都會(huì)有TIMP-1,2 的存在。Xu[7]等報(bào)道表示：人滋養(yǎng)細(xì)胞會(huì)分泌出MMP-2,9 以及對MMP-2,9 進(jìn)行調(diào)節(jié)，另外還會(huì)分泌以及調(diào)節(jié)組織抑制物TIMP-2,1，孕期達(dá)到6 周后滋養(yǎng)細(xì)胞就能夠泌出MMP-2，孕期達(dá)7 周后MMP-9 水平會(huì)持續(xù)升高。蔣德菊等[8]研究顯示，患有稽留流產(chǎn)個(gè)體體內(nèi)的TIMP-1表達(dá)率增加，因此預(yù)測在稽留流產(chǎn)發(fā)病期間，MMP-9/TIMP-1的動(dòng)態(tài)失衡對其有著極大的影響。

炎癥對妊娠有極大的影響，胎膜提早被破以及早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)提高的原因，跟細(xì)胞因子與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)之間出現(xiàn)動(dòng)態(tài)失衡的情況息息相關(guān)[9]。MMP 能夠由好幾種細(xì)胞類型所形成。于正常個(gè)體組織里，運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)幾乎檢驗(yàn)不到MMP 的存在，不過當(dāng)個(gè)體被損傷及個(gè)體懷孕時(shí)，其體內(nèi)的蛋白質(zhì)沉積會(huì)加多。MMP 能夠?qū)⒓?xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的好幾類蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，且經(jīng)過分解基質(zhì)中關(guān)鍵的支架大分子而踴躍參加重塑ECM 活動(dòng)。MMP 與TIMP 共同維持動(dòng)態(tài)平衡，以保證孕早期正常及胎盤發(fā)育順利。明膠酶MMP-2和MMP-9 是尤其涉及成功細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤在妊娠早期，因?yàn)樗鼈兪窃诨啄?，其主要由IV 型膠原蛋白的降解被認(rèn)為關(guān)鍵酶[10]。MMP 的組織抑制劑（例如TIMP-1 和TIMP-2）調(diào)節(jié)蛋白酶的活性。胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲子宮內(nèi)膜后，會(huì)對人胎盤實(shí)行介導(dǎo)作用。某種特定的蛋白水解酶的分泌可以對子宮內(nèi)膜基底膜以及子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解，而且這種酶的分泌能夠精準(zhǔn)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲。在自然終止妊娠中，MMP-9 含量以及MMP-2/TIMP-2 復(fù)合物含量的增加對此也許存在影響[11-12]。

綜上所述，MMP-2 和TIMP-2 在子宮內(nèi)膜中的研究比較廣泛，涉及了多種婦科疾病。經(jīng)過研究得出，MMP-2 的表達(dá)水平以及TIMP-2 的表達(dá)水平在患有稽留流產(chǎn)個(gè)體的絨毛組織中處于明顯性降低狀態(tài)。另外MMP 和TIMP 都參與組織重塑，伴隨著組織的快速生長和結(jié)構(gòu)變化。由于妊娠是一個(gè)動(dòng)態(tài)的環(huán)境，并且MMP 在整個(gè)妊娠過程中都對其持續(xù)重塑做出了貢獻(xiàn)，因此有必要對該領(lǐng)域進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

總而言之，可得出結(jié)論：也許在稽留流產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制中，MMP-2/TIMP-2 的存在非常關(guān)鍵，不過對其在分子調(diào)控機(jī)制方面的詳情未能明確，因此，我們將在未來的研究中探討具體的分子調(diào)控通路。