古漢養(yǎng)生精改善新型冠狀病毒肺炎疫情期間醫(yī)務(wù)人員抑郁癥的機(jī)制分析

李祥，瞿穎東，寇曉旺，曠昕*

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬龍華區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001）

0 引言

2019 年12 月，新型冠狀病毒肺炎（簡(jiǎn)稱“新冠肺炎”；novelcoronaviruspneumonia，NCP）在世界蔓延，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。由于確診及死亡例數(shù)迅速增加，部分醫(yī)務(wù)人員和公眾出現(xiàn)了抑郁等心理問(wèn)題，尤其是與患者直接接觸、戰(zhàn)斗在抗擊疫情一線的醫(yī)務(wù)人員[2]。抑郁癥是一種精神心理疾病的臨床癥狀。研究表明，誘發(fā)因素包括遺傳因素、慢性病、心理環(huán)境、社會(huì)環(huán)境因素等。其中，遺傳基因決定了抑郁癥的易感性，而環(huán)境因素是抑郁癥的誘發(fā)因素[3]。目前抗抑郁癥仍以西醫(yī)為主，但西醫(yī)治療目標(biāo)單一，存在抗抑郁藥譜窄、療效慢、副作用大等弊端。中藥具有成分多、副作用小、療效好、協(xié)同作用強(qiáng)、整體調(diào)節(jié)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在抑郁癥的治療中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。湖南著名中醫(yī)專家李聰甫、劉炳凡、歐陽(yáng)锜在1985 年馬王堆漢墓出土的古代中醫(yī)書(shū)籍的基礎(chǔ)上，結(jié)合人參、黃芪、淫羊藿、黃精、枸杞子、菟絲子、女貞子等藥材，提出了馬王堆養(yǎng)生的文化思想[4]。古語(yǔ)曰：“天有三寶日、月、星；地有三寶水、火、風(fēng)；人有三寶精、氣、神。[5]”在秦朝以前，精氣神一直被視為人體存在的基礎(chǔ)，因此認(rèn)為：“精脫者死、氣脫者死、失神者死”[6]。因此古漢養(yǎng)生精也可改善抑郁癥等精神疾病。中醫(yī)藥的作用機(jī)制往往是多種成分、途徑和靶點(diǎn)的相互作用，但傳統(tǒng)的研究方法很難從這一層面研究古漢養(yǎng)生精的作用機(jī)制。系統(tǒng)藥學(xué)作為一門新興的科學(xué)，打破了“一藥一靶一病”的傳統(tǒng)思維模式和框架[7]。結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)、多方位藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等學(xué)科的技術(shù)手段和內(nèi)容，構(gòu)建了一個(gè)從整體角度探討藥物與疾病關(guān)系的多層次網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)是非常系統(tǒng)和整體的，與中醫(yī)治病的整體觀和辨證論治的原則相符[8]。在此基礎(chǔ)上，本文將通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和預(yù)測(cè)古漢養(yǎng)生精改善疫情期間醫(yī)務(wù)人員抑郁癥的生物學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 古漢養(yǎng)生精的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP）（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）是 中 藥 材化學(xué)成分及靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)，在Herbname 中分別輸入“淫羊藿”“枸杞”“女貞子”“菟絲子”“金櫻子”“白芍”“人參”“黃芪”“黃精”“麥芽”“甘草”等11 個(gè)中藥獲取古漢養(yǎng)生精化學(xué)成分及靶點(diǎn)。

1.2 篩選活性化合物

口服生物利用度（oral availability，OB）是藥代動(dòng)力學(xué)中藥物吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程中最重要的參數(shù)，口服藥物生物利用度是衡量生物活性分子( 即有效分子) 藥代動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵指標(biāo)，它是指口服藥物到達(dá)體循環(huán)占口服劑量的比例[9]。為了排除古漢養(yǎng)生精中成藥性低的化合物，用類藥性（drug likeness，DL）評(píng)估指數(shù)來(lái)優(yōu)化化合物的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，例如水溶性和化學(xué)穩(wěn)定性[10]。藥物半衰期（Half-life evaluation of drugs，DHL）是指“化合物在體內(nèi)減至初始值的一半所需的時(shí)間”，這是化合物產(chǎn)生療效時(shí)間的最重要屬性[11]。中藥大部分是通過(guò)口服，穿過(guò)小腸黏膜上皮屏障，進(jìn)入體內(nèi)。腸上皮細(xì)胞（Intestinal absorption model，Caco-2）決定藥物進(jìn)入人體的速度和程度，最終影響中藥生物利用度[12]。因此，本文以口服生物利用度閾值OB ≥35%、類藥性閾值DL ≥0.18、藥物半衰期閾值DHL ≥4h、腸吸收閾值Caco-2 ≥0.2 作為活性化合物篩選的條件，篩選出古漢養(yǎng)生精中活性高的化合物，以提高數(shù)據(jù)分析和處理的價(jià)值。

1.3 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-疾病

網(wǎng)絡(luò)將古漢養(yǎng)生精活性化合物和疾病相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建出化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)軟件自帶工具可視化分析，以推測(cè)古漢養(yǎng)生精可能的藥理作用機(jī)制原理，并以靶點(diǎn)度值（Degree）和中介中心度（betweeness centrality）兩個(gè)重要指標(biāo)評(píng)價(jià)古漢養(yǎng)生精中活性化合物及靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network)

蛋白質(zhì)相互作用是指參與同一細(xì)胞的生物化學(xué)過(guò)程的蛋白質(zhì)必須通過(guò)相互作用組成大分子化合物才能完成其生物學(xué)過(guò)程或功能。因此，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)有助于分析蛋白質(zhì)在生物過(guò)程中的功能。將篩選出的古漢養(yǎng)生精靶點(diǎn)基因傳入STRING 網(wǎng)站（https://string-db.org/），為保證篩選條件的高置信度，本文設(shè)置評(píng)分條件參數(shù)>0.90，去除圖中單獨(dú)的蛋白質(zhì)，最后輸出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI 圖，進(jìn)行可視化研究分析，并根據(jù)結(jié)果計(jì)算靶點(diǎn)基因關(guān)聯(lián)頻次。

1.5 GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析GO 功能富集分析包含了三個(gè)重要的功能信息

基因參與的生物過(guò)程、基因所處的細(xì)胞位置、基因發(fā)揮的分子功能。KEGG 通路富集分析是由日本開(kāi)發(fā)的基因數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)庫(kù)，并且該數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)聯(lián)到David 數(shù)據(jù)庫(kù)，可進(jìn)行通路查詢。為了闡明古漢養(yǎng)生精的靶蛋白在信號(hào)通路中的作用，先將靶蛋白通過(guò)Uniprot 網(wǎng)站進(jìn)行基因代碼轉(zhuǎn)換，再通過(guò)R 語(yǔ)言中David6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)函數(shù)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，以了解古漢養(yǎng)生精改善抑郁癥的相關(guān)機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 古漢養(yǎng)生精化合物篩選表

古漢養(yǎng)生精活性化合物的篩選古漢養(yǎng)生精中化合物共有1258 種。 以O(shè)B ≥35%、DL ≥0.18、DHL ≥4h、Caco-2 ≥0.2 作為篩選條件，選取活性化合物共166 種。除去重復(fù)后共126 種。見(jiàn)表1。

表1 古漢養(yǎng)生精化合物篩選表

2.2 古漢養(yǎng)生精化合物-靶點(diǎn)

相互作用網(wǎng)絡(luò)對(duì)化合物及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)處理后，通過(guò)Cytoscape 3.7.2 構(gòu)圖后得到化合物- 靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖1）。在該網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)288 個(gè)。Degree 代表網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)相連的路線的數(shù)目，節(jié)點(diǎn)大小與Degree 正相關(guān)。軟件自帶拓?fù)鋵W(xué)工具分析結(jié)果如下：網(wǎng)絡(luò)集中度：0.531；網(wǎng)絡(luò)密度：0.040；網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性：1.524；最短路徑：72092（100%）。網(wǎng)絡(luò)中有269 個(gè)節(jié)點(diǎn)( 其中中藥化合物節(jié)點(diǎn)115 個(gè)，靶基因節(jié)點(diǎn)151 個(gè))，見(jiàn)圖1。度值最高者分別為山奈酚（kaempferol）、β- 谷甾醇（beta-sitosterol）、異鼠李素（isorhamnetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、芒柄花素（formononetin），這些度值較高的化合物可能是古漢養(yǎng)生精改善抑郁癥的關(guān)鍵化合物，見(jiàn)表2。

表2 度值前5 位的化合物

2.3 古漢養(yǎng)生精PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

基于蛋白質(zhì)相互作用原理推測(cè)古漢養(yǎng)生精治療抑郁癥的機(jī)制，本文通過(guò)STRING 網(wǎng)站構(gòu)建了古漢養(yǎng)生精靶標(biāo)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖2）。選擇置信度>0.90，去除獨(dú)立的靶標(biāo)蛋白。通過(guò)網(wǎng)站生成的PPI 網(wǎng)絡(luò)有152 個(gè)節(jié)點(diǎn)，494 條邊，平均Degree 為6.5，圖2 中節(jié)點(diǎn)表示靶標(biāo)蛋白，每條邊代表靶標(biāo)蛋白之間的相互作用關(guān)系。選取Degree 值較高的30 個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白繪制出條形圖（見(jiàn)圖3）。其中JUN 度值（Degree=28）最高，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中有重要作用。

圖2 古漢養(yǎng)生精靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 蛋白質(zhì)信息條形圖

2.4 GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析

使用R 語(yǔ)言中關(guān)于DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)函數(shù)對(duì)古漢養(yǎng)生精靶蛋白基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集，結(jié)果分別有150 富集結(jié)果和164 富集結(jié)果，使用Bonferroni 算法進(jìn)行調(diào)整，得到各條富集通路的P值（P<0.01 是顯著富集，P值越小代表富集越顯著），根據(jù)P值排序列舉前20 個(gè)通路進(jìn)行分析，見(jiàn)表3、4。

表3 前20 位GO 通路富集表

表4 前20 位KEGG 通路富集表

3 討論

目前，隨著社會(huì)對(duì)疫情關(guān)注，對(duì)醫(yī)務(wù)人員身心健康也逐步重視。但抑郁癥發(fā)病機(jī)制還不完全明確，有學(xué)者對(duì)近年來(lái)抑郁癥機(jī)制的研究進(jìn)行了總結(jié)：γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去甲腎上腺素(nor-epinephrine，NE)及多巴胺等都是腦內(nèi)最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其功能紊亂與抑郁癥發(fā)病關(guān)系密切[13]。另外神經(jīng)免疫通路的激活和抑郁的關(guān)系近年來(lái)受到關(guān)注[14]。現(xiàn)基于已有研究文獻(xiàn)，結(jié)合上述研究推演古漢養(yǎng)生精改善抑郁癥的機(jī)制。

古漢養(yǎng)生精中活性化合物共166 種，與抑郁癥相關(guān)的靶基因152 個(gè)。根據(jù)化合物- 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，黃酮類化合物在度值和中介中心度都高于平均值以上的化合物中，推測(cè)是古漢養(yǎng)生精的核心成分，如kaempferol、betasitosterol、isorhamnetin、formononetin、Stigmasterol 等。黃酮類化合物在自然界的植物中廣泛存在，屬于植物生成產(chǎn)物。黃酮類化合物具有多方面藥用價(jià)值，比如預(yù)防和治療心腦血管疾病、鎮(zhèn)咳、排痰、緩解哮喘和殺菌，以及保護(hù)肝臟、排毒、治療多種肝炎、改善肝硬化、抑制氧自由基生成和抗氧化作用[15]。黃酮類化合物在神經(jīng)系統(tǒng)中的藥理作用逐漸被重視，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有改善抑郁、解除焦慮、緩解中樞神經(jīng)抑制、治療精神分裂癥、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、緩解疼痛、改善學(xué)習(xí)記憶、影響神經(jīng)內(nèi)分泌等多種功能，但其通過(guò)多種受體和信號(hào)通路，作用機(jī)制非常復(fù)雜[16-17]。在這些研究中，一些黃酮類化合物被發(fā)現(xiàn)具有與抑郁癥發(fā)病機(jī)制相同的作用靶點(diǎn)，推測(cè)古漢養(yǎng)生精可能是通過(guò)這些靶點(diǎn)改善抑郁癥。黃酮類化合物kaempferol 是古漢養(yǎng)生精的主要活性成分，其中度值與中介中心度遠(yuǎn)超過(guò)過(guò)其他化合物。kaempferol 有預(yù)防癌癥發(fā)生、抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、減輕炎癥、抗氧化、殺菌、抗病毒等多種功能而受到研究者的廣泛關(guān)注[18]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)在CUMS 抑郁癥模型大鼠中，使用kaempferol 能通過(guò)抑制自噬和氧化應(yīng)激減輕海馬神經(jīng)元的損傷[19]。蒲公英在小鼠抑郁模型中的抗抑郁作用是由于皮質(zhì)酮水平的抑制和絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（MKP-1）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)的調(diào)節(jié)[20]。因此，推測(cè)kaempferol 可能通過(guò)抑制自噬、減輕氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)BDNF 等途徑改善抑郁癥。在靶標(biāo)蛋白互作中，c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)屬于絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中受應(yīng)激激活的一類激酶.眾多研究表明,在神經(jīng)萎縮、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、心理應(yīng)激事件中均顯著涉及JNK 的激活,而這些事件均與抑郁癥緊密相聯(lián).近年來(lái)運(yùn)用基因敲除和JNK 抑制劑等手段證明JNK 的確參與抑郁癥狀的調(diào)控;同時(shí)不少抗抑郁藥的療效涉及對(duì)JNK 活性的調(diào)節(jié),這些已初步確立JNK與抑郁癥之間的關(guān)聯(lián)[21]。淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）基因表達(dá)的淀粉樣蛋白前體蛋白通過(guò)分泌酶水解，生成了具有神經(jīng)毒性的β 淀粉樣蛋白肽和蛋白沉淀，這是阿爾茨海默病的重要病理因素之一，但APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠在情緒上表現(xiàn)出了抑郁樣行為[22]。在腫瘤、糖尿病以及精神分裂癥等疾病中可以見(jiàn)到AKT 信號(hào)通路調(diào)節(jié)異常。在腫瘤突變中，過(guò)度激活這條通路可引起細(xì)胞變化，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。但在精神方面疾病中，由于抑制這條通路使中樞神經(jīng)元和海馬干細(xì)胞功能發(fā)生下降，繼而導(dǎo)致精神異常[23]。

結(jié) 果 表 明，GO 的 富 集 途 徑 有150 條，KEGG 的 富 集途徑有164 條，主要是通過(guò)AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Th17 cell differentiation、HIF-1 signaling pathway 等關(guān)鍵信號(hào)通路發(fā)揮有效的治療作用。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是一種由還原糖的醛基與體內(nèi)多種蛋白質(zhì)的脂蛋白、氨基組、脂質(zhì)等發(fā)生氧化反應(yīng)以及非酶糖基化反應(yīng)的終產(chǎn)物，可以與自身，也可以與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，繼而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)一系列促炎癥和促凝血反應(yīng)[24]。AGE/RAGE 信號(hào)可激活包括NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPKs 在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，導(dǎo)致NF-κB 激活。抑郁癥患者血清中NFκB、TNF-α、IL-8 水平升高提示炎癥反應(yīng)參與了抑郁癥的發(fā)病機(jī)制[25]。在電針抗抑郁實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)通過(guò)下調(diào)RAGE 的表達(dá)，可以發(fā)揮抗神經(jīng)損傷作用，改善抑郁[26]。淫羊藿苷Ⅱ可下調(diào)APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的APP、Aβ1-42、RAGE 蛋白水平，抑制炎癥[27]。人參皂甙RG3 能抑制創(chuàng)面皮膚AGEs 的沉積，調(diào)節(jié)高氧化應(yīng)激狀態(tài)[28]。TH17 細(xì)胞在包括自身免疫組織損傷在內(nèi)的炎癥反應(yīng)中起著重要作用，主要分泌IL-17A、IL-22 和TNF-α 等[29]。TH17 細(xì) 胞 分 泌 的IL-17A 和IL-22可通過(guò)血腦屏障，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子進(jìn)入腦內(nèi)或激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，引起或加重腦內(nèi)炎癥[30]。研究人員還發(fā)現(xiàn)，TH17 細(xì)胞在小腸中的分布更為廣泛，可以被腸道微生物群調(diào)節(jié)，這一發(fā)現(xiàn)支持了抑郁癥發(fā)病機(jī)制的腦-腸軸假說(shuō)，也就是說(shuō)，應(yīng)激引起的腸道微生物群破壞導(dǎo)致TH17 細(xì)胞增多，產(chǎn)生大量IL-17A 進(jìn)入大腦觸發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)損傷和抑郁[31]。古漢養(yǎng)生精組方中淫羊藿和枸杞均能維持Tregs 和TH17 的功能平衡，改善器官免疫損傷[32-33]。

為了探討古漢養(yǎng)生精改善疫情期間醫(yī)務(wù)人員抑郁癥的機(jī)理，運(yùn)用系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建了“化合物-靶標(biāo)-通路”生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)。我們結(jié)合數(shù)據(jù)模型，預(yù)測(cè)了古漢養(yǎng)生精的主要活性成分、核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵途徑，在分析大量文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，提出了古漢養(yǎng)生精改善抑郁癥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用機(jī)制，提示了其改善抑郁癥的機(jī)制，希望為改善疫情期間醫(yī)務(wù)人員身心健康提供一些理論依據(jù)。同時(shí)本研究也具有一定的局限性，希望進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。