度洛西汀通過調(diào)控JNK和NF-κB信號通路對急性心肌梗死大鼠心功能的影響

孫云，谷慧平

急性心肌梗死（AMI）是流向心臟的血流減少或完全停止，是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)死亡或致殘的主要疾病之一[1]。在AMI后，氧自由基等活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生增加，激活多種信號通路導(dǎo)致炎性反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡，最終引起心功能受損和心室重構(gòu)，嚴(yán)重影響預(yù)后[2]。在AMI后心肌損傷過程中，主要的通路是c-Jun氨基末端激酶，（JNK）通路和核因子（NF）-κB，這兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活均會誘導(dǎo)其靶基因的過表達，包括白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等[3,4]。度洛西汀是一種抗抑郁和調(diào)控周圍神經(jīng)功能的藥物，最新研究顯示度洛西汀可緩解心肌缺血再灌注后的心律失常，提示其具有保護心功能的作用[5]。也有研究顯示度洛西汀有顯著的抗炎作用[6]，據(jù)此推測度洛西汀可能通過抑制炎性反應(yīng)緩解AMI后的心肌損傷，從而提高心功能。本次研究主要分析度洛西汀通過調(diào)控JNK和NF-κB信號通路對AMI動物模型心功能的影響，探究作用機制，為治療AMI提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料SD大鼠（SPF級，雄性，220～250 g，上海斯萊克實驗動物中心，中國）。度洛西汀（江蘇恩華，H20130056）。小動物呼吸機（Inspira ASV，哈佛儀器公司，美國）。BL-420F小動物生物功能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司，中國）。Mayer's蘇木精和0.5%曙紅水溶液（H8070，DH0050，北京Solarbio公司，中國）。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒（碧云天公司，中國）。酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，美國）。組織勻漿機（Thermo Fisher Scientific公司，美國）。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒購自瑞士Roche公司。RIPA裂解緩沖液（中國，北京，Beyotime）。BCA試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司，中國）。抗體購自美國Abcam公司。PVDF膜（Bio-Rad公司，美國）。顯微鏡（Olympus 公司，日本）。

1.2 動物分組、建模和干預(yù)40只大鼠隨機分為4組（n=10）：Sham組、AMI組和AMI+低劑量度洛西汀（AMI+L）組和AMI+高劑量度洛西?。ˋMI+H）組。AMI組、AMI+L組和AMI+H組大鼠按照參考文獻進行結(jié)扎建立AMI模型[7]，通過腹腔注射1%戊巴比妥（劑量為3 ml/kg）使大鼠麻醉，染后仰臥固定在無菌操作板上，將針電極皮下插入四肢，使用12導(dǎo)聯(lián)心電圖通過四肢導(dǎo)線進行監(jiān)測。消毒剃毛后在第三、四肋間隙處剪開，將大鼠插管并連接呼吸機（潮氣量3 ml/kg，呼吸頻率60～70 次/ min）。切開并暴露左胸腔，打開心包，使用6/0線結(jié)扎左前降支，心臟表面立即變?yōu)樯罴t色，心電圖ST段抬高。保持結(jié)扎30 min；取出絲線行再灌注，縫合胸腔，術(shù)后肌注80萬單位青霉素防止感染。Sham組大鼠在行相同操作但不結(jié)扎。建模后AMI+L組和AMI+H組大鼠均腹腔注射度洛西汀，根據(jù)人與大鼠的體重?fù)Q算，劑量分別為40 mg/kg和80 mg/kg。Sham組和AMI組大鼠使用等量溶劑腹腔注射作為對照，1/d，連續(xù)7 d，干預(yù)后對大鼠進行后續(xù)研究。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 心功能指標(biāo)通過BL-420F生物功能實驗系統(tǒng)檢測心功能，該系統(tǒng)的2個通道用于檢測左室收縮末期壓力（LVESP）和左室舒張末期壓力（LVEDP），通過4通道顯示2通道心室收縮期間左心室壓力的最大上升和下降速率（±dP/dt max）。

1.3.2 HE染色檢測心肌梗死面積和心肌組織損傷情況大鼠吸入過量的二氧化碳麻醉后斷頭處死，取出心臟沿結(jié)扎線分為兩半，以保留結(jié)扎線和心尖之間的區(qū)域。將組織用4%多聚甲醛固定并用梯度醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度5 μm的組織玻片標(biāo)本。加入Mayer's蘇木精在室溫下賦孵育10 min，加入0.5%曙紅溶液室溫下賦予3 min。根據(jù)HE染色結(jié)果，測定心肌組織左心室壁厚度（LVWT），室間隔厚度（IVST），內(nèi)外膜弧長和疤痕內(nèi)外周長，使用Image Pro Plus 6.0軟件計算心肌梗死面積。梗死面積=（內(nèi)膜的弧長+外膜的弧長）/（疤痕的內(nèi)周+疤痕的外周）×100%。

1.3.3 TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡按照1.3.3的方法制備心肌組織玻片標(biāo)本，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)處理后用密封液封閉。將切片在37℃的混合工作溶液（20 μg/ml蛋白酶K溶液PH=7.5～8.0）中孵育并修復(fù)15 min。加入50 μl的TUNEL反應(yīng)溶液，37℃下孵育1 h，使用PBST洗滌切片，加入100 μl的二氨基聯(lián)苯胺在37℃下孵育30 min，用PBST洗滌，最后在顯微鏡下觀察樣品。隨機選擇每個組織的四個視野觀察，計算凋亡指數(shù)=凋亡核數(shù)/（凋亡核數(shù)+正常細(xì)胞核數(shù)）×100%。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）大鼠麻醉后處死，采集心臟內(nèi)的血液樣本，離心（2000 rpm，20 min）后收集上層血清。根據(jù)試劑盒說明書分別加入抗體和顯色劑，通過酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-6、TNF-α、超氧化歧化酶（SOD） 、丙二醛（MDA）的濃度。

1.3.5 實時熒光定量PCR（qPCR）使用Trizol獲得心肌組織中總RNA并檢測檢測RNA的濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg RNA用于合成cDNA（42℃下60 min，70℃下5 min，4℃保存）。 使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR檢測系統(tǒng)進行qPCR實驗（95℃/10 min，40個循環(huán)，94℃/15 s，60℃/1 min， 60℃/1 min，4℃保存）。比較循環(huán)閾值（ΔΔCt）用于分析RNA的表達。GAPDH和U6用于標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）將心肌組織用勻漿機均勻研磨。蛋白濃度通過雙BCA試劑盒測量。分別取總量為40 μg的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳（PAGE）（80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白（BSA）中于室溫孵育1 h。將1:500稀釋的anti-Nrf2、anti-HO-1添加到分離的蛋白質(zhì)中，并在4℃下孵育過夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影。GAPDH用作內(nèi)部參考，用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0軟件。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 度洛西汀對AMI大鼠心功能指標(biāo)比較四組間的心功能指標(biāo)比較差異顯著（P＜0.05），其中AMI組的LVESP、±dP/dt max顯著低于Sham組而LVEDP顯著高于Sham組（P＜0.05），AMI+L組和AMI+H組的LVESP、±dP/dt max顯著高于AMI組而LVEDP顯著低于AMI組（P＜0.05），且對于LVESP、±dP/dt max，AMI+H組顯著高于AMI+L組（P＜0.05）；對于LVEDP，AMI+H組顯著低于AMI+L組（P＜0.05），表1。

表1 度洛西汀對AMI大鼠心功能指標(biāo)比較

2.2 度洛西汀對AMI大鼠心肌梗死面積的影響四組間的心肌梗死面積比較差異顯著（P＜0.05）。其中Sham組無心肌梗死，AMI組的梗死面積為（2.41±0.39 mm2），P＜0.05；AMI+L組的梗死面積為（2.02±0.42 mm2），顯著小于AMI組（P＜0.05）；AMI+H組的梗死面積為（1.69±0.41 mm2），顯著小于AMI組和AMI+L組（P＜0.05），見圖1和表2。

圖1 HE染色檢測度洛西汀對AMI大鼠心肌梗死面積的影響

表2 度洛西汀對AMI大鼠心肌梗死面積的影響

2.3 度洛西汀對AMI大鼠心肌組織損傷的影響Sham組的心肌細(xì)胞成纖維狀有序排列，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色均勻，細(xì)胞核飽滿；AMI組大鼠心肌細(xì)胞染色不均勻，排列紊亂，并出現(xiàn)炎性浸潤；AMI+L組的心肌組織也出現(xiàn)了炎性浸潤，但細(xì)胞排列基本正常；AMI+H組的心肌細(xì)胞染色不均勻，但排列有序，有少量炎性損傷（圖2）。

圖2 HE染色檢測度洛西汀對AMI大鼠心肌組織損傷的影響

2.4 度洛西汀對AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響四組間的心肌凋亡指數(shù)比較差異顯著（P＜0.05）。其中Sham組的心肌凋亡指數(shù)為（3.80±0.56%），AMI組的凋亡指數(shù)為（32.75±3.67%），顯著高于Sham組（P＜0.05），AMI+L組的凋亡指數(shù)為（21.12±2.74%），顯著小于AMI組（P＜0.05）；AMI+H組的凋亡指數(shù)為（16.64±3.11%），顯著小于AMI組和AMI+L組（P＜0.05），見圖3及表3。

表3 度洛西汀對AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖3 TUNEL染色檢測度洛西汀對AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 度洛西汀對AMI大鼠血清炎性因子和氧化應(yīng)激因子的影響四組間的炎性因子和氧化應(yīng)激因子水平比較差異顯著（P＜0.05）。AMI組的IL-6（19.52±3.84 pg/ml）、TNF-α（16.03±2.69 pg/ml）、MDA（14.98±1.83 nmol/ml）顯著高于Sham組，SOD（55.37±9.63 U/ml）顯著低于Sham組（P＜0.05）。AMI+L組的IL-6（15.77±2.21 pg/ml）、TNF-α（11.83±2.04 pg/ml）、MDA（11.08±1.47 nmol/ml）顯著低于AMI組，SOD（65.14±12.74 U/ml）顯著高于AMI組（P＜0.05）；AMI+H組的IL-6（12.02±2.34 pg/ml）、TNF-α（8.73±1.97 pg/ml）、MDA（8.26±1.25 nmol/ml）顯著低于AMI+L組，SOD（79.53±13.01 U/ml）顯著高于AMI+L組（P＜0.05），表4。

表4 度洛西汀對AMI大鼠血清炎性因子和氧化應(yīng)激因子的影響

2.6 度洛西汀對AMI大鼠心肌組織中JNK和NF-κB mRNA的影響四組間的JNK和NF-κB mRNA水平比較差異顯著（P＜0.05）。AMI組的JNK和NF-κB mRNA的水平顯著高于Sham組（P＜0.05）。AMI+L組的JNK和NF-κB mRNA的水平顯著低于AMI組（P＜0.05）；AMI+H組的JNK和NF-κB mRNA的水平顯著低于AMI+L組（P＜0.05），表5。

表5 度洛西汀對AMI大鼠心肌組織中JNK和NF-κB mRNA的影響

2.7 度洛西汀對AMI大鼠心肌組織中JNK和NF-κB蛋白的影響四組間的JNK和NF-κB通路水平比較差異顯著（P＜0.05）。AMI組的JNK和NF-κB蛋白的水平顯著高于Sham組（P＜0.05）。AMI+L組的JNK和NF-κB蛋白的水平顯著低于AMI組（P＜0.05）；AMI+H組的JNK和NF-κB蛋白的水平顯著低于AMI+L組（P＜0.05），見圖4及表6。

表6 度洛西汀對AMI大鼠心肌組織中JNK和NF-κB蛋白的影響

圖4 Western blot檢測度洛西汀對AMI大鼠心肌組織中JNK和NF-κB通路的影響

3 討論

心血管疾病是世界人口死亡的主要原因，在我國缺血性心臟病尤其是AMI的發(fā)生率和致死、致殘率逐年上升[8]。近年來，炎癥在心肌梗死中的重要性已引起廣泛關(guān)注。在AMI后再灌注中，會造成氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)，促進心肌細(xì)胞凋亡，從而永久影響心功能。臨床通過介入手術(shù)或其他手術(shù)方法可進行血運重建恢復(fù)心肌灌注，但術(shù)后再灌注造成的損傷則加重促炎反應(yīng)，無法預(yù)防局部缺血引起的進行性心肌纖維化[9]。在AMI后2～7 d心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量的凋亡和炎性損傷，但這種凋亡是可逆的，有效抑制心肌細(xì)胞炎性損傷和凋亡對提高預(yù)后具有重要意義[10]。目前尚無針對AMI后再灌注造成的心肌細(xì)胞損傷的有效額干預(yù)手段。

度洛西汀是一種新型抗抑郁藥物，具有抑制炎性反應(yīng)、改善神經(jīng)損傷的作用[11]。一項最新研究顯示度洛西汀可改善AMI大鼠模型的心電圖異常，提高心功能，并對后續(xù)的心律失常有很好的抑制作用[5]。對于冠心病患者，度洛西汀可明顯抑制炎性因子[12]。本研究通過結(jié)扎的方法構(gòu)建AMI模型，通過灌胃低劑量和高劑量度洛西汀進行干預(yù)，結(jié)果顯示在1周后，AMI組大鼠的心功能受到顯著抑制，且心臟梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高。度洛西汀可劑量依賴性的減少心肌梗死面積和凋亡指數(shù)，并劑量依賴性的提高心肌功能。Toda等[13]研究顯示度洛西汀可明顯抑制腦缺血再灌注損傷，保護神經(jīng)元，并在腦組織缺血后，抑制凋亡誘導(dǎo)因子的表達，保護神經(jīng)元功能，緩解缺血再灌注后的損傷[14]。提示在AMI大鼠模型中，度洛西汀會劑量依賴性的抑制梗死后的心肌細(xì)胞凋亡減少梗死面積，從而提高心功能，但關(guān)于度洛西汀緩解AMI心肌細(xì)胞凋亡和促進心功能的機制需進一步研究。

為進一步分析度洛西汀緩解AMI的機制，我們檢測了氧化應(yīng)激水平、JNK和NF-κB信號通路以及下游炎性因子的水平。在早期急性缺血中，心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死的主要形式，但在梗死后2～7 d的繼發(fā)性凋亡也是影響AMI預(yù)后的主要原因，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制急性心肌缺血后的細(xì)胞凋亡是治療AMI的主要策略[15]。缺血及再灌注會直接引起多種活性氧自由基升高，直接激活JNK和NF-κB信號通路，JNK和NF-κB具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，JNK和NF-κB會直接促進炎性基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達水平[16,17]。研究已經(jīng)證實了JNK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活會直接促進IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄，并促進氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡。本次研究結(jié)果也顯示AMI組的JNK和NF-κB mRNA和蛋白的水平均顯著升高，且血清IL-6和TNF-α和氧化應(yīng)激水平也升高，而AMI+L組和AMI+H組的JNK和NF-κB mRNA和蛋白的水平均顯著低于AMI組，血清IL-6和TNF-α和氧化應(yīng)激水平也低于AMI組，度洛西汀對JNK和NF-κB mRNA和蛋白的抑制作用具有劑量依賴性。研究顯示5-羥色胺去甲腎上腺素再攝取抑制劑具有明顯的抑制JNK及下游MAPK通路的作用[18]。在化學(xué)療法誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病動物模型中，度洛西汀可顯著抑制JNK通路和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活和核易位，從而減少炎性因子的表達[19]。Zhou等[20]研究結(jié)果顯示度洛西汀會抑制NF-κB蛋白的表達。提示在AMI大鼠模型中，通過度洛西汀灌胃會明顯抑制缺血及再灌注引起的JNK和NF-κB相關(guān)通路的激活，從而抑制炎性因子的表達，抑制凋亡保護心功能。

綜上所述，度洛西汀可能通過抑制JNK和NF-κB通路抑制AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護心功能的作用。但關(guān)于度洛西汀對AMI的治療作用和安全性仍需動物實驗和臨床實驗分析，其調(diào)控JNK和NF-κB的機制值得深入研究。