致對蝦肝胰腺壞死病副溶血弧菌熒光定量PCR 檢測方法的建立

陳平亞，張亮亮，吳少榮，黃紀(jì)徽，王綏家，吳山楠

（?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心，海南 海口 570311）

【研究意義】對蝦急性肝胰腺壞死?。ˋcute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND）是一種細菌性病害，通常在放苗35 d 左右暴發(fā)，病死率高，曾造成我國海南、廣東、福建和廣西對蝦養(yǎng)殖場大面積發(fā)病。該病一般在高溫干旱季節(jié)的高鹽、高堿養(yǎng)殖池中具有較高的發(fā)病幾 率［1］。斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）和中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）都是 AHPND 的易感種群［2］。患病對蝦出現(xiàn)空腸空胃或腸斷節(jié)，肝胰腺萎縮或腫大、呈紅褐色或發(fā)白，甲殼變軟等癥狀，死亡率極高。AHPND 的組織學(xué)病理特征是肝胰腺上皮細胞脫落，由于血細胞活動形成黑色素沉積，在該病晚期肝胰腺內(nèi)的黑點更加明顯，并有大量血細胞聚集［3-4］。AHPND 病原菌是一種攜帶PVA1 毒素質(zhì)粒的嗜鹽海洋性副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND）。嗜鹽海洋性副溶血性弧菌與已知的副溶血性弧菌分離株的基因不同，這種新菌株攜帶一個或多個染色體外PVA1 質(zhì)粒。并非所有副溶血弧菌都表現(xiàn)出AHPND 致病性［5］，PVA1 質(zhì)粒攜帶編碼毒素蛋白的基因卻能夠?qū)е翧HPND。因此依據(jù)PVA1 質(zhì)粒設(shè)計特異性引物和探針對嗜鹽海洋性副溶血性弧菌的檢測十分必要。

【前人研究進展】對VpAHPND全基因組測序發(fā)現(xiàn)，其攜帶了約 69 kb 大小的毒力質(zhì)粒，包含一組共軛轉(zhuǎn)移基因和兩個質(zhì)粒啟動基因，是一種自傳遞的質(zhì)粒［6-7］。毒力質(zhì)粒具備質(zhì)粒解離后致死系統(tǒng)，可防止質(zhì)粒在后代細胞中發(fā)生丟失，這種毒性質(zhì)粒可通過接合傳播，并可在受體中永久遺傳［8］?；蚯贸蜃匀蝗狈ir毒素基因，可使菌株明顯喪失致病能力，因此推斷Pir 毒素可能是AHPND 的主要致病因子。該質(zhì)粒能編碼表達轉(zhuǎn)座酶、類病毒蛋白PirA、pirB等毒素蛋白質(zhì)，pirB毒素主要決定副溶血弧菌的毒力，PirA致病力相對較弱［9］。AHPND 質(zhì)粒攜帶株的質(zhì)?？截悢?shù)在很低的情況下分泌的毒素對對蝦的致病性很高，說明毒素蛋白的分泌不取決于該質(zhì)粒的拷貝數(shù)［10］。具有pirB基因但缺失PirA基因的突變菌不會引起AHPND 病害，但對對蝦仍有40%的致病性［11-12］。

【本研究切入點】本研究針對pirB基因設(shè)計特異性引物和探針，對AHPND 進行檢測。由于甲殼動物缺乏特異性免疫機制，AHPND 缺乏有效的防治措施［13］，因此及早檢測和診斷水產(chǎn)動物是否被感染，并采取相應(yīng)措施防止該病毒繼續(xù)擴散，是水產(chǎn)養(yǎng)殖減少損失的有效途徑?！緮M解決的關(guān)鍵問題】AHPND 的常規(guī) PCR 檢測方法是以pirAvp毒力基因為靶基因來檢測VpAHPND，通過檢測pirA毒力基因拷貝數(shù)實現(xiàn)對VpAHPND的定量檢測，從而分析病原菌的侵染途徑，但pirA毒力基因的分子檢測結(jié)果陽性強度低，本試驗以pirB毒力基因為靶基因建立實時熒光PCR 方法，以期有效檢測VpAHPND。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株由?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心動物實驗室分離保存，包括VpAHPND-HK190423 株、單增李斯特菌Listeria monocytogenes、糞 腸球菌Enterococcus faecalis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、福氏志賀氏菌Shigella flexneri、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、大腸埃希氏菌Escherichia coli、阪崎腸桿菌Enterobacter sakazakii、傷寒沙門氏菌Salmonella enteritidis、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、河流弧菌Vibrio fluvialis、創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus、哈氏弧菌Vibrio harveyi等。對蝦樣品從?？谑兄苓厡ξr養(yǎng)殖場采集，包括45 份凡納濱對蝦、57 份斑節(jié)對蝦和42 份中國對蝦。

試驗主要試劑：Taq酶、dNTP 等試劑購自TaKaRa（大連）公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；感受態(tài)細胞DH5α、Pmd18-T-Simple Vector、限制性內(nèi)切酶和T4 連接酶購自大連寶生物公司；3%APW 培養(yǎng)基、TCBS、營養(yǎng)瓊脂購于北京陸橋技術(shù)公司。試驗主要儀器：ABI ViiATM7 實時定量 PCR 儀、北京六一DYY－6C 型電泳儀、英國UVItec 公司凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 試驗方法

1.2.1pirB基因特異性引物、探針設(shè)計 從GenBank 上獲得VpAHPND菌株pirB基因序列，應(yīng)用Oligo6.0 軟件設(shè)計引物和探針。引物pirBF：5'-TTCATATTCACCTGCTGTTGG-3'，pirBR：5'-ACGATTTCGACGTTCCCCAA-3'；TaqMan 探針：5'-FAM-ACTATATTGCTACAGGTACGG AAGATGA-TAMRA-3'。引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 巢式PCR擴增 質(zhì)粒AP4-1引物：F1：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'；R1：5'-ACGATTTCGACGTTCCCCAA-3'。質(zhì)粒AP4-2引物：F2：5'-TTGAGAATACGGGACGTGG G-3'；R2：5'-GTTAGTCATGTGAGCACCTTC-3'。反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.0 μL，AP4-1上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，dNTP（10 mmol/L）4 μL，TaqDNA聚合酶 1.0 μL，模板DNA 4 μL，加ddH2O補至25 μL。擴增程序為：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、71 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 4 min。取第一步的PCR產(chǎn)物，進行第二步nested-PCR。反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 3.0 μL，AP4-2上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dNTP（10 mmol/L）4 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，第一步PCR產(chǎn)物 4 μL，加ddH2O補至25 μL。擴增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、56℃30 s、72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 2 min。

1.2.3pirB基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)pirB基因序列，設(shè)計特異性引物克隆pirB基因。采用 Primer 6.0引物設(shè)計軟件，設(shè)計帶酶切位點的特異性引 物，F(xiàn)：5'-CGGGATCCATGACTAACGAATACG TTGTAAC-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點），R：5'-CCGCTCGAGCTACTTTTCTGTACCAAATTC ATCG-3'（下劃線部分為XohⅠ酶切位點）。以提取的VpAHPND菌株 DNA 為模板，使用上述引物進行PCR 擴增，反應(yīng)體系（25 μL）：2 ×PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。將含有目的基因片段的PCR 產(chǎn)物和載體用BamH Ⅰ和XohⅠ酶切，T4 連接酶連接到pMD18-T 載體中制備重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂在含有氨芐青霉素鈉的LB瓊脂平板上，挑單個獨立菌落接種至LB培養(yǎng)基中，搖床震蕩培養(yǎng)14 h。經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒回收、純化，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒作為陽性外參對照。質(zhì)?？截悢?shù)按照公式計算：拷貝數(shù)（拷貝/μL）=質(zhì)粒濃度（g/μL）× 6.02 × 1023/質(zhì)粒分子量，質(zhì)粒分子量=堿基對平均分子量（660）×重組質(zhì)?？傞L度（2692+1172），測得拷貝數(shù)為2.3×107拷貝/μL。

1.2.4pirB基因?qū)崟r熒光PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化以2.3×107拷貝/μL 標(biāo)準(zhǔn)品DNA 為模板，在56～65 ℃范圍內(nèi)，以1 ℃梯度進行熒光定量PCR擴增，以獲得最低循環(huán)數(shù)（Ct）值和較高的相對熒光強度增加值（ΔRn）時的退火溫度。采用引物不同終濃度（0.1～0.6 μmol/L）與探針不同終濃度（0.10～0.50 μmol/L）組合進行熒光定量PCR，以獲得最低的Ct 值和較高的ΔRn 時的引物和探針濃度組合。反應(yīng)體系補充ddH2O 至25 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。選取ΔRn 值最大且所用引物和探針濃度最小為反應(yīng)體系。

1.2.5 熒光定量PCR 的特異性、靈敏度、重復(fù)性試驗 以VpAHPND菌株、單增李斯特菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌、阪崎腸桿菌、傷寒沙門氏菌、溶藻弧菌、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈氏弧菌等病原體作為陰性對照菌株，并用ddH2O 作為無模板空白對照驗證熒光PCR 法檢測副溶血性弧菌pirB基因的特異性。

對已知拷貝數(shù)含有目的擴增片段的PMD18-pirB重組質(zhì)粒進行10 倍梯度稀釋，以各梯度質(zhì)粒為模板進行熒光PCR 檢測，確定該方法對靶基因的最低檢出限。

設(shè)計4 組樣品，分別取108、107、106、105濃度的VpAHPND菌株P(guān)MD18-pirB重組質(zhì)粒進行PCR 試驗，每組4 次組內(nèi)重復(fù)，測Ct 值求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差S，計算各組變異系數(shù)CV，以檢測的Ct 值變異系數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)偏差/重復(fù)值的平均數(shù)）初步評估該方法的重復(fù)性。

1.3 對蝦樣品熒光RT-PCR 方法的應(yīng)用

分別取3 種對蝦0.5 g 鰓和肝胰腺組織于1.5 mL 離心管中，加入0.5 mL 滅菌生理鹽水后研磨勻漿，按照基因組DNA 快速提取試劑盒按說明書提取總DNA 作為模板。用建立的TaqMan 探針熒光定量PCR 進行檢測，同時采用世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的套式PCR 法檢測樣品，檢測結(jié)果與熒光探針法進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆載體的構(gòu)建

以VpAHPND菌株提取的DNA 為模板，經(jīng)PCR獲得的目的片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得pirB基因的特異性條帶（1 172 bp，圖1）?；厥占兓瘮U增PCR 產(chǎn)物并與pMD18-T 克隆載體連接獲得重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-pirB，目的基因和重組克隆質(zhì)粒同時用BamH Ⅰ和XohⅠ進行酶切、T4 連接酶連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中進行擴增，篩選陽性克隆子pMD18-T-pirB，并對陽性克隆載體進行雙酶切驗證，經(jīng)BamH Ⅰ/XohⅠ雙酶切鑒定，有一條大小約1 200 bp的片段，與目的片段大小一致，另一條大小約2 600 bp 的載體片段，與克隆載體pMD18-T 大小一致（圖2）。

圖1 pirB 基因擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of pirB gene

圖2 pMD18-T-pirB 質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identification of pMD18-T-pirB plasmid

2.2 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

引物和探針濃度篩選試驗結(jié)果表明，采用0.5 μmol/L 引物和0.2 μmol/L 探針進行檢測，獲得的Ct 值最小且熒光增加值較大，因此確定引物和探針的最佳濃度分別為0.5、0.2 μmol/L。對熒光定量PCR 反應(yīng)體系中其余各組分濃度進行優(yōu)化，最終確定優(yōu)化后的副溶血性弧菌pirB熒光PCR 反應(yīng)體系（25 μL）為：Probe qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各1.0 μL，探針1.0 μL，模板2 μL，用滅菌ddH2O 補足至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。在每次延伸結(jié)束時收集熒光信號。

2.3 熒光定量PCR 特異性分析

用所建立的RT-PCR 檢測方法對VpAHPND菌株、單增李斯特菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌、阪崎腸桿菌、傷寒沙門氏菌、溶藻弧菌、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈氏弧菌等病原菌進行檢測，結(jié)果顯示只有VpAHPND菌株出現(xiàn)典型的擴增曲線，而其他對照菌株和空白對照均未出現(xiàn)擴增曲線。說明建立的熒光定量PCR 法對VpAHPND的檢測具有很強的特異性（圖3）。

圖3 TaqMan PCR 方法特異性分析Fig.3 Specific analysis of TaqMan PCR method

2.4 pMD18-T-pirB 質(zhì)粒RT-PCR 靈敏度分析

用ddH2O將2.3×107拷貝/μL的pMD18-TpirB質(zhì)粒作10倍系列稀釋，取各個稀釋度作熒光PCR檢測確定其最低檢出限，結(jié)果顯示在pMD18-T-pirB質(zhì)粒拷貝數(shù)為2.3×101時，Ct值為34.27，表明該檢測方法至少能檢測到2.3個質(zhì)?？截悢?shù)（圖4）。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實際檢測中以 Ct值 35為界限，若檢測樣品的Ct值≤35，且有擴增曲線，則判為VpAHPND陽性；Ct值＞35，且有擴增曲線，則重復(fù)1次，如結(jié)果一致判為VpAHPND陽性；Ct 值＞35，重復(fù)結(jié)果未出現(xiàn)擴增曲線，判為VpAHPND陰性。

圖4 TaqMan PCR 方法靈敏性分析Fig.4 Sensitivity analysis of TaqMan PCR method

2.5 pMD18-T-pirB 質(zhì)粒RT-PCR 重復(fù)性分析

對樣品進行組間重復(fù)性試驗，組內(nèi)重復(fù)性分析分別選取108、107、106、105/μL 濃度的pMD18-T-pirB質(zhì)粒，按照程序進行PCR 試驗，結(jié)果見圖5。根據(jù)4 次組內(nèi)重復(fù)計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，變異系數(shù)CV介于0.45 %～0.69 %之間（表1），組內(nèi)重復(fù)性良好，穩(wěn)定性強。

圖5 熒光定量PCR 組間重復(fù)試驗分析Fig.5 Intra repeatability test analysis of real-time PCR

表1 熒光定量PCR 組間重復(fù)試驗分析Table 1 Intra repeatability test analysis of real-time PCR

2.6 熒光定量PCR 方法的應(yīng)用

應(yīng)用建立的RT-PCR 方法對采集的45 份凡納濱對蝦、57 份斑節(jié)對蝦和42 份中國對蝦樣品進行VpAHPND檢測，分別檢出陽性樣品19、7、6 份，陽性率分別為24.4%、12.3%、14.2%。檢測結(jié)果與OIE 推薦的套式PCR 法檢測結(jié)果一致，說明該方法檢測實際樣本具有較高可靠性。

3 討論

通過基因組測序發(fā)現(xiàn)，一些非副溶血性弧菌屬的AHPND 致病原被確定攜帶PVA1 質(zhì)粒，如哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、歐文斯氏弧菌（Vibrio owensii）和坎貝氏弧菌（Vibrio campbellii）［14-15］，說明這些毒力基因能夠被傳播到不同的弧菌種類中，并且質(zhì)粒基因的結(jié)構(gòu)表明pirA和pirB基因的缺失或獲得可通過水平基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)位或同源重組而發(fā)生流動，因此AHPND 可能不僅可由副溶血弧菌引起，也能由攜帶 PVA1 質(zhì)粒的其他弧菌屬引起［16］，因此根據(jù)PVA1 質(zhì)粒設(shè)計特異性引物和探針減少了檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性的概率。

試驗取病蝦肝胰腺組織在3%APW 培養(yǎng)肉湯中增菌后，提取DNA 后擴增不出陽性條帶，而直接取病蝦肝胰腺組織提取DNA 后，能夠擴增出陽性條帶。副溶血弧菌廣泛存在于環(huán)境中，推測可能是樣品中的其他副溶血弧菌在增菌過程中逐漸取代了VpAHPND菌株成為優(yōu)勢菌株，致使毒素基因很難再被檢測到［17］。本試驗在對病蝦臨床樣品的VpAHPND檢測時選擇直接對肝胰腺組織提取DNA 作為模板。對本試驗擴增的所有陽性片段經(jīng)過測序，所得序列有98.7%同源性，因此這些菌株可能都起源于一個單一克隆。應(yīng)用建立的RTPCR 方法對采集的45 份凡納濱對蝦、57 份斑節(jié)對蝦和42 份中國對蝦樣品進行VpAHPND檢測，檢出陽性樣品32 份，檢測結(jié)果與OIE 推薦的套式PCR 法檢測結(jié)果一致。

開展AHPND 診斷，最精確的采樣部位是腸道等器官［18］，但發(fā)病前鰓可能有更靈敏的病原菌檢出，發(fā)病高死亡率期間，肝胰腺是最靈敏的可檢測組織，而在發(fā)病后期，除了肝胰腺和腸道外，也可選擇肌肉組織作為樣本［19］。本試驗針對蝦鰓、肝胰腺、腸胃等不同部位取樣進行檢測，鑒別在水體傳播AHPND 過程中不同部位的感染過程。

AHPND 的常規(guī)PCR 檢測方法是以pirA毒力基因為靶基因來檢測VpAHPND，通過檢測pirA毒力基因拷貝數(shù)實現(xiàn)對VpAHPND的定量檢測［20］，從而分析病原菌的侵染途徑，但pirA毒力基因的分子檢測結(jié)果陽性強度低，本試驗以pirB毒力基因為靶基因建立實時熒光PCR 方法，結(jié)果表明該方法能有效檢測VpAHPND。

4 結(jié)論

本試驗針對對蝦急性肝胰腺壞死病病原菌副溶血性弧菌建立了PCR 擴增方法，根據(jù)其質(zhì)粒保守序列設(shè)計了特異性引物及探針，優(yōu)化了PCR 反應(yīng)的退火溫度、引物及探針濃度等參數(shù)，能夠有效檢測目標(biāo)基因。當(dāng)pirB基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度范圍為 2.3×101～2.3×107拷貝/μL 時，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系。該方法靈敏度高，最低檢測限為2.3 拷貝/μL；特異性強，與對蝦其他病原菌無交叉反應(yīng)；重復(fù)性好，重復(fù)試驗變異系數(shù)為0.45%～0.69%?？稍? h 內(nèi)完成對蝦樣品的實時熒光定量檢測，臨床檢測結(jié)果與世界動物衛(wèi)生組織推薦的套式PCR 法檢測結(jié)果一致，可用于臨床對蝦樣品的VpAHPND檢測。及早檢測和診斷水產(chǎn)動物是否感染急性肝胰腺壞死病并采取相應(yīng)措施防止該病菌擴散，有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的提前預(yù)警，是水產(chǎn)養(yǎng)殖減少損失的有效途徑。