羅非魚湖病毒S10 基因編碼蛋白的表達及單克隆抗體的制備

王雅慧，王英英，王 慶，李 波，李瑩瑩，尹紀元，楊 廣，曾偉偉

（1.天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津 300384；2.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁藥創(chuàng)制重點實驗室/廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510385；3.佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院/廣東省動物分子設計與精準育種重點實驗室/普通高校動物分子設計與精準育種重點實驗室，廣東 佛山 440605）

【研究意義】羅非魚因生長快、食性雜、病害少、肉質(zhì)好、產(chǎn)量高等優(yōu)點，已被引入中國、印度尼西亞和埃及等90 多個國家并被廣泛養(yǎng)殖。預計2021 年全球羅非魚產(chǎn)量將達到729 萬t，為僅次于鯉科魚類的全球第二大養(yǎng)殖魚類［1］。中國是羅非魚的主要養(yǎng)殖和生產(chǎn)基地，養(yǎng)殖量約占全球30%［2］。羅非魚具有較強的抗病性和抗逆性，適合集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)，是一種廉價的蛋白質(zhì)來源。但近年來羅非魚病害頻生，給全球羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重制約羅非魚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。其中，自2009 年開始，在以色列、厄瓜多爾、埃及、泰國、印度等多國相繼暴發(fā)的一種新發(fā)疫病——羅非魚湖病毒病（Tilapia Lake Virus Disease，TiLVD），給全球羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅和嚴峻挑戰(zhàn)［3］。該病病原為一種新型RNA 病毒——羅非魚湖病毒（Tilapia Lake Virus，TiLV）。目前，對于 TiLV 致病機制、TiLV 基因組中各節(jié)段基因功能均不清楚，對TiLVD 尚無有效的防控措施。因此，針對TiLV 的單抗抗體制備對于TiLV 病原學研究及TiLVD 防控均具有重要意義。

【前人研究進展】TiLV 是一種包膜病毒［4-5］，其基因組由10 個單股負鏈RNA 片段組成，共編碼14 個功能蛋白［6-7］。目前，國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICVT）將TiLV 作為一個新種，單獨列為羅非魚湖病毒屬、羅非魚病毒新科［8］。Til-4-2011 是第一個完成全基因組測序的TiLV 分離株［3］，其S1節(jié)段包含1 個與正粘病毒科C 型流感病毒（ICV）PB1 亞基具有序列同源性的開放讀碼框，最初將TiLV 確定為一種新型正粘病毒樣病毒［5］。后續(xù)研究表明，S1、S2、S4 和S5 節(jié)段與Dhori 病毒有很強的同源性，S6、S7 和S8 與流感病毒進化上接近，而S3 節(jié)段與傳染性鮭魚貧血病毒有較弱的同源性［6］。TiLV 各基因節(jié)段編碼的蛋白功能均未知。生物信息學分析和預測表明，TiLV S10 基因節(jié)段編碼的蛋白含有一個溴結(jié)構(gòu)域。溴結(jié)構(gòu)域是一類保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，能特異性識別乙?；嚢彼岵⑿纬沈?qū)動活性轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)復合物，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄［9］。相比于其他9 種蛋白，TiLV S10 編碼蛋白具有更豐富的抗原表位［10］，提示S10 編碼蛋白具有更強的免疫原性。

【本研究切入點】羅非魚對TiLV 高度敏感，在各個養(yǎng)殖階段都能受TiLV 感染，以早期發(fā)育階段的發(fā)病率和死亡率相對更高，死亡率在20%～90%之間［11］。水平傳播是羅湖病毒重要的傳播途徑之一［4］，健康魚可通過受TiLV 污染的水和設備感染TiLV［12］。感染魚的腸道中和糞便中均可檢測到TiLV 基因組RNA，表明極有可能存在糞口傳播途徑。近年來的研究表明，在2 日齡魚苗中檢測到TiLV，在病魚生殖器官中也能檢出TiLV 基因組RNA 和活病毒，表明TiLV 可能存在垂直傳播途徑［13］。迄今為止，針對TiLV 的感染尚無有效的防治辦法。加強TiLV 病原學基礎研究、開發(fā)高效的疫苗和有效的防治藥物是當前TiLVD 防控研究的熱點和重點。

【擬解決的關(guān)鍵問題】TiLV 基因組S10 基因節(jié)段編碼的蛋白具有較強的免疫原性和重要的生物學功能。本研究利用原核表達系統(tǒng)獲得S10 重組蛋白，并將純化的重組蛋白免疫小鼠，經(jīng)融合和篩選獲得陽性雜交瘤細胞株，然后制備抗S10蛋白的MAb，并對MAb 的生物學特性進行鑒定，為后續(xù)深入研究S10 蛋白的功能、TiLV 病原學以及疫苗和藥物的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pET-32a（+）載體、小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）均為中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所病害防控與免疫實驗室保存；用于增殖TiLV 的TiB細胞系由該實驗室建立并保存［14］，Escherichia coliDH5α 和E.coliBL21 感受態(tài)細胞購自北京康為世紀生物科技有限公司，6 周齡SPF 雌性BALB/c 小鼠購自廣東省實驗動物中心，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗兔IgG、FITC 標記的羊抗鼠IgG、HRP 標記羊抗鼠IgG、HT、HAT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和PEG3350 均購自Sigma-aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、DMEM-20 完全培養(yǎng)基、蛋白質(zhì)Marker、RIPA 裂解液、限制性核酸內(nèi)切酶（BamH Ⅰ和Hind Ⅲ）和 T4 DNA 連接酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，MiniBEST DNA Fragment Purification Kit、Prime STAR Max DNA Polymerase 購自寶生物工程（大連）有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自廣州飛揚生物工程有限公司，SDS-PAGE 試劑盒、超敏化學發(fā)光顯色液購自新賽美生物科技有限公司，小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組表達質(zhì)粒pET32a-S10 的構(gòu)建 根據(jù)TiLV S10 全長基因序列（GenBank 登錄號：KU751823.1）設 計PCR 引 物，S10-F 序 列：5'GCT GGA TCC ATG AGT GTG GCA GAT TAT 3'（下劃線為BamH Ⅰ酶切位點），S10-R 序列：5' GCG AAG CTT ACG TCA AGA GAC TTC TTC C 3'（下劃線為HindⅢ酶切位點）。以中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所病害防控與免疫實驗室保存的TiLV cDNA 為模板，使用引物組S10 F/R 擴增目的基因片段，PCR 反應程序為 95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后與pET32a 載體分別用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶在37 ℃下雙酶切20 min，然后分別進行純化回收?；厥债a(chǎn)物按比例配置好連接體系后，在T4 DNA 連接酶作用下22 ℃連接20 min，然后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行酶切驗證，驗證正確后送至上海生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒即為pET32a-S10，擴大培養(yǎng)后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 S10 重組蛋白的表達及純化 將重組質(zhì)粒pET32a-S10 轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單菌落于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6 左右時，添加終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 于28 ℃條件下誘導表達（未誘導組不加IPTG）。將誘導表達后的重組菌液于10 000 r/min、4 ℃離心8 min 收集菌體，按100 mL 裂解緩沖液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，5% 甘 油，1 %Triton 100，pH 值8.0）與1 L 重組菌液的體積比進行重懸，冰浴條件下以超聲波破碎30 min，10 000 r/min、4 ℃離心30 min，分別收集上清及沉淀，將收集的上清用鎳柱進行純化。收集不同濃度咪唑洗脫的洗脫產(chǎn)物進行SDS-PAGE 檢測，分析蛋白純化效果并利用BCA 法測定目的蛋白濃度。將純化好的S10重組蛋白分裝后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠免疫 用純化的S10 重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化完全后，皮下注射BALB/c 小鼠，每只小鼠的免疫劑量為100 μg 重組蛋白。2 周后進行第2 次免疫，取等體積的弗氏不完全佐劑與純化的S10 重組蛋白均勻乳化后進行皮下注射，免疫劑量與第1 次免疫相同。二免后2 周和4 周分別進行第3、4 次免疫，方法和劑量與第2 次免疫相同。第4 次免疫1 周后，尾靜脈采血測定抗血清效價，效價達到 1 ∶10 000以上時用100 μg S10 重組蛋白直接腹腔注射BALB/c 小鼠加強免疫。

1.2.4 雜交瘤細胞株的克隆與篩選 參照文獻［15-16］建立雜交瘤細胞株的方法，細胞融合前，在無菌條件下制備小鼠脾細胞懸液。骨髓瘤細胞SP2/0 與免疫小鼠脾細胞按比例進行細胞融合。待融合細胞生長至96 孔板培養(yǎng)面積的1/4～1/3 時，取100 μL 細胞培養(yǎng)上清用間接ELISA 方法進行檢測，篩選出陽性且效價較高的細胞進行克隆純化，將可以穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)并于液氮中長期保存。

1.2.5 MAb 純化和亞型鑒定 將陽性的雜交瘤細胞經(jīng)BALB/c 小鼠腹腔注射，待小鼠腹腔膨大時收集并純化腹水，得到純化的MAb，于-80 ℃保存。使用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對篩選后的MAb 進行鑒定，按照試劑盒說明書進行操作。結(jié)果可通過酶標儀讀取450 nm 波長的OD 值或直接觀察判讀，OD 值最高或顏色最深孔對應的即為相應亞型。

1.2.6 間接ELISA 檢測MAb 效價 在酶聯(lián)板中包被抗原，4 ℃放置過夜，PBST 洗板3 次，吸水紙上拍干，用5%脫脂奶37 ℃封閉2 h，洗板，每孔加入MAb 100 μL，加蓋在37 ℃孵育1～2 h，每個樣品平行做2～3 份，PBS 作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。洗板，每孔加酶標抗抗體100 μL，加蓋在37 ℃孵育1 h，洗板后每孔加入辣根過氧化物酶反應的顯色液100 μL，顯色5 min，每孔加入 2 mol/L 硫酸終止液50 μL，終止反應。用酶標儀測定 450 nm 波長各待測孔的OD值，若樣品OD 值和陰性對照OD 值之比大于 2.1（P/N ＞2.1），則結(jié)果判為陽性。

1.2.7 Western-blot 鑒定MAb 特異性 用S10 重組蛋白、感染TiLV 的TiB 細胞及未感染病毒的TiB 細胞對MAb 進行特異性分析。將S10 重組蛋白、TiLV 感染和未感染的TiB 細胞進行SDSPAGE 分析，電轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜（NC 膜）上，NC 膜于5%的脫脂奶粉溶液下37 ℃孵育2 h，PBST 洗滌后加入1 ∶100 稀釋的MAb 4 ℃封閉過夜，PBST 洗滌，加入1 ∶1 000 稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 標記抗體，室溫下溫和振蕩結(jié)合1 h，PBST 洗滌，加入超敏化學發(fā)光顯色液避光顯色，于化學發(fā)光成像系統(tǒng)（BIO-RAD，Gel Doc XR ＋system）觀察結(jié)果。

1.2.8 IFA 鑒定MAb 特異性 在24 孔板中培養(yǎng)單層的TiB 細胞，TiLV 接毒96 h 后，參照文獻［17］的IFA 操作步驟，結(jié)果于熒光倒置顯微鏡（Nikon，EclipseTi-S）下觀察，陰性抗原對照為正常TiB細胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 S10 基因的擴增及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以S10 基因序列為模板進行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖1）顯示，在300～400 bp 之間可見一條特異性條帶，與預期目的片段314 bp 結(jié)果相符。BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后也出現(xiàn)約314 bp 的條帶，與預期結(jié)果相符。測序結(jié)果進一步證實擴增片段與S10 基因序列一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并將其命名為pET32a-S10。

圖1 TiLV S10 基因PCR 擴增產(chǎn)物及pET32a-S10 酶切鑒定結(jié)果Fig.1 PCR amplification products of TiLV S10 gene and restriction enzyme identification result of pET32a-S10

2.2 S10 重組蛋白的表達與純化

將重組質(zhì)粒pET32a -S10 轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞內(nèi)，在28 ℃條件下IPTG 誘導表達12 h 后，經(jīng)SDS-PAGE 電泳，結(jié)果（圖2）顯示，與未誘導組相比，誘導組在40 ku 與30 ku之間有一條特異的蛋白條帶，與預期的蛋白分子質(zhì)量大小一致，且蛋白在上清和包涵體中均獲得表達。經(jīng)鎳柱純化后的目的蛋白純度較高，條帶單一無明顯雜帶。

圖2 重組S10 蛋白表達與純化結(jié)果Fig.2 Expression and purification results of recombinant S10 protein

2.3 MAb 篩選和亞型鑒定

將骨髓瘤細胞SP2/0 與免疫小鼠脾細胞融合后經(jīng)過4 次亞克隆，利用間接ELISA 方法對上清進行檢測，篩選出2 株可穩(wěn)定分泌抗TiLV-S10蛋白的MAb 雜交瘤細胞株，分別命名為2C3 和2E3。用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對其分泌的抗體進行亞型鑒定，結(jié)果顯示，2C3 抗體為IgG1/к 型，2E3 抗體為IgG2a/к 型。

2.4 MAb 效價

2C3 和2E3 腹水抗體純化后濃度分別為1.05、1.14 mg/mL，抗體稀釋200 倍后進一步倍比稀釋，用間接ELISA 法測定制備的雜交瘤細胞株效價，空白對照 OD450值為0.114，結(jié)合酶聯(lián)結(jié)果陽性判斷標準，得出2C3 和2E3 腹水抗體效價分別為1 ∶12 800、1 ∶51 200。

2.5 Western-blot 鑒定MAb 特異性

以空載蛋白為陰性對照，S10 重組蛋白以及純化的TiLV 經(jīng)由SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)印至NC 膜上，以純化后的2C3 和2E3 MAb 為一抗，HRP 標記的羊抗鼠IgG 為二抗。結(jié)果（圖3）顯示，2C3 和2E3 MAb均能與S10蛋白和純化的TiLV發(fā)生反應，目的條帶約為38 ku，與預期結(jié)果相符，表明制備的2C3 和2E3 MAb 均可特異性識別TiLV。

圖3 Western blot 分析兩種MAbs 的特異性結(jié)果Fig.3 Western blot analysis of the specificity of two MAbs

2.6 間接免疫熒光鑒定MAb 特異性

以制備的2C3 和2E3 MAb 作為一抗，與感染TiLV 的TiB 細胞和未感染TiLV 的TiB 細胞進行IFA 試驗鑒定，結(jié)果（圖4）顯示，2C3 和2E3 能對病毒感染的TiB 細胞產(chǎn)生特異性的綠色熒光，與未感染病毒的TiB 細胞呈現(xiàn)陰性反應，說明制備的2C3 和2E3 兩株抗S10 蛋白MAb 具有良好的特異性。

圖4 IFA 反應特性鑒定（400×）Fig.4 Reactivity identification of IFA（400×）

3 討論

TiLV 從2009 年發(fā)現(xiàn)至今，有關(guān)其病原學和基因功能研究鮮有報道，病毒基因組各節(jié)段基因編碼蛋白的功能和特征尚未明確，對其結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用、病毒增殖的調(diào)控及致病機理等方面，還有待全面研究和深入探索。通過對TiLV 各蛋白的功能研究和了解，有助于更深入了解該病毒的復制過程以及病毒感染過程中的分子機制。MAb 在病毒的病原學基礎研究、診斷技術(shù)和疫苗開發(fā)以及基因功能研究等方面均具有重要作用［18］。由于目前還沒有針對TiLV 的防治方案，早期監(jiān)控和免疫預防將成為防控該疾病的主要手段。此外，MAb 對于病毒感染具有巨大治療潛力，具有中和活性的MAb 可以直接中和病毒，從而阻止病毒的擴散和增殖。隨著MAb 技術(shù)的發(fā)展，其在治療感染性疾病中占據(jù)不可替代的地位［19］。

溴結(jié)構(gòu)域廣泛存在于真核細胞中，可以識別乙?；嚢彼釟埢囊活惐Ｊ氐鞍捉Y(jié)構(gòu)域［9］。研究表明，許多與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以及與染色質(zhì)有關(guān)的蛋白質(zhì)都存在溴結(jié)構(gòu)域，根據(jù)結(jié)構(gòu)序列，可以把含溴結(jié)構(gòu)域蛋白（BCPs）劃分為八大家族，目前研究較為深入的是具有表觀遺傳學靶點，與多種疾病關(guān)系緊密，并在介導基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控細胞周期中發(fā)揮重要作用的第Ⅱ家族溴結(jié)構(gòu)域與超末端結(jié)構(gòu)域［20-21］。目前，還有許多溴結(jié)構(gòu)域的功能尚未明確，在水生動物上的研究與應用更是如此。通過TiLV S10 序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白中含有1 個溴結(jié)構(gòu)域，可能與TiLV 的基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)，但由于S10 蛋白相關(guān)研究較少，其潛在的結(jié)構(gòu)與功能未知，針對S10 蛋白的重組表達和單抗制備可為該蛋白的功能研究和TiLV 免疫學診斷奠定基礎。

本研究通過構(gòu)建載體pET32a-S10，并對其進行誘導表達，SDS-PAGE 分析顯示表達的蛋白大小約為38 ku。通過Western blot 分析證實該蛋白質(zhì)具有良好的反應原性。以純化的S10 重組蛋白為免疫原，制備并篩選出2 株能夠穩(wěn)定高效分泌抗TiLV MAb 的雜交瘤細胞株，間接ELISA 分析結(jié)果顯示，2 株細胞株制備的MAb 效價分別為1 ∶12 800、1 ∶51 200。Western blot 和IFA 證實，2 種MAb 均能特異性識別S10 蛋白和TiLV。2 種MAb 均可識別TiLV 病毒S10 蛋白上的某一抗原表位，而該抗原表位的具體結(jié)構(gòu)特征，則有待進一步深入探究。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了含有TiLV 基因組S10 節(jié)段的原核表達載體pET32a-S10，經(jīng)IPTG 誘導可表達出大小約為38 ku 的目的重組蛋白。利用純化的重組蛋白免疫小鼠，經(jīng)多輪篩選和鑒定，最終獲得2 株能夠分泌抗S10 編碼蛋白MAb 的雜交瘤細胞株，其編號分別為2C3、2E3。其中2C3細胞株分泌的抗體為IgG1/к 型，2E3 分泌的抗體為 IgG2a/к 型，2 株細胞株經(jīng)注射小鼠制備的MAb 效價分別為1 ∶12 800 和1 ∶51 200。經(jīng)Western blot 和IFA 分析證實，2 種MAb 均能與TiLV 特異性反應。本研究制備的MAb 特異性好，抗體效價高，可為后續(xù)TiLV S10 蛋白結(jié)構(gòu)功能研究、TiLV 疫苗研發(fā)、治療手段以及診斷試劑的開發(fā)提供重要基礎材料。