微小RNA-425-5p靶向調(diào)控PTEN表達(dá)促進(jìn)宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的實驗研究

高慧，王麗，王景華

宮頸癌是全球婦女中常見的第四大惡性腫瘤，給女性的身體健康和生活質(zhì)量造成很大的威脅。認(rèn)識和了解宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制是實現(xiàn)全面消除宮頸癌的第一步。既往研究顯示，在宮頸癌中存在著異常表達(dá)的微小RNA（miRNAs/miR），而這些miRNAs 是宮頸癌病理進(jìn)展過程的重要調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)，miR-425-5p在宮頸癌病人組織和血清中高表達(dá)，與病人臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等緊密聯(lián)系，但miR-425-5p 在宮頸癌中的詳細(xì)功能與機(jī)制仍未完全闡明。本研究于2018年10月至2019年10月考察miR-425-5p 在宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、侵襲和遷移中的作用，并探討其潛在的分子機(jī)制，以期為宮頸癌發(fā)病機(jī)制的深入研究提供新的啟示。

1 材料與方法

1.1 海拉細(xì)胞培養(yǎng)

海拉細(xì)胞（美國ATCC）采用含10% 胎牛血清（美國Gibco BRL 公司）的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM 培養(yǎng)基）（美國Hyclone 公司）在常規(guī)條件為5% 二氧化碳、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）中培養(yǎng)。

1.2 海拉細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在6 孔板中接種5×10個對數(shù)生長期的海拉細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)至70%～80% 融合度時，參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）說明書步驟進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染miR-425-5p 模擬物（mimics）/抑制劑（inhibitor）（上海吉瑪制藥公司）的細(xì)胞作為miR-425-5p mimics/inhibitor 組，轉(zhuǎn)染miR-425-5p mimics/inhibitor 陰性對照（上海吉瑪制藥公司）的細(xì)胞作為mimics/inhibitor-NC 組；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTEN 過表達(dá)載體質(zhì)粒（上海欽誠生物公司）的細(xì)胞作為pcDNA3.1-PTEN 組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 空載體質(zhì)粒（上海欽誠生物公司）的細(xì)胞作為pcDNA3.1 組；轉(zhuǎn)染PTEN 干擾序列siRNAPTEN（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）的細(xì)胞作為siRNA-PTEN 組，轉(zhuǎn)染siRNA-PTEN 陰性對照（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）的細(xì)胞作為siRNANC 組。轉(zhuǎn)染5 h 后，更換新鮮DMEM 培養(yǎng)基并維持48 h。

1.3 實時熒光定量PCR檢測海拉細(xì)胞中miR-425-5p表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染48 h后的miR-425-5p mimics/inhibitor組、mimics/inhibitor-NC組海拉細(xì)胞，加入1 mL Trizol試劑（上海碧云天生物公司）獲取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司）隨附步驟將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；以獲得的產(chǎn)物互補(bǔ)DNA（cDNA）作為模板，參照定量PCR試劑盒（美國Applied Biosystems公司）說明書[miR-425-5p 正向引物序列為5’-TGCGGAATGAC-ACGATCACTCCCG-3’，反向引物序列為5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6正向引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’（上海吉瑪制藥公司）］并按照設(shè)定的PCR擴(kuò)增條件（95 ℃2 min 后，進(jìn)入40個循環(huán)階段：95 ℃10 s、60 ℃20 s、72 ℃20 s；72 ℃5 min）上PCR 儀（德國Roche Diagnostics GmbH 公司）進(jìn)行擴(kuò)增。采用2法計算各組海拉細(xì)胞中miR-425-5p的相對于U6的表達(dá)水平。

1.4 MTT 法檢測海拉細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后5×10個miR-425-5p mimics/inhibitor 組、mimics/inhibitor-NC 組海拉細(xì)胞接種至96 孔板，并設(shè)置空白調(diào)零組：無細(xì)胞培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，每孔加入20 μL（濃度為5 g/L）噻唑藍(lán)（MTT）溶液（美國Sigma 公司）；孵育4 h 后，棄上清液并每孔加入200 μL DMSO（美國Sigma 公司）震蕩反應(yīng)15 min。在酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）490 nm 波長處檢測各組海拉細(xì)胞吸光度，并計算出各組細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=（實驗組吸光度－空白組吸光度）/（對照組吸光度－空白組吸光度）×100%］。實驗重復(fù)3 次。后續(xù)pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTEN 組、siRNA-NC 組和siRNA-PTEN組細(xì)胞增殖活力檢測方法同上。

1.5 平板克隆形成實驗檢測海拉細(xì)胞克隆形成能力

胰蛋白酶（美國Hyclone 公司）消化收集miR-425-5p mimics/inhibitor 組、mimics/inhibitor-NC 組細(xì)胞，在培養(yǎng)皿中分別接種50、100 和200個細(xì)胞，每組設(shè)置3個平行實驗。輕輕搖動使其分散均勻后，常規(guī)培養(yǎng)14～21 d。期間觀察到培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。以4% 多聚甲醛固定20 min，0.1% 結(jié)晶紫染色15 min。沖洗并干燥后，在顯微鏡（日本Olympas公司）中觀察并計數(shù)大于15個細(xì)胞的克隆數(shù)，并根據(jù)克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100% 計算出克隆形成率（%）。后續(xù)pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTEN 組、siRNA-NC 組和siRNA-PTEN 組細(xì)胞克隆形成率檢測方法同上。

1.6 Transwell 小室實驗檢測海拉細(xì)胞侵襲和遷移

（1）侵襲實驗：將無血清培養(yǎng)基和Matrigel 基質(zhì)膠（美國BD 公司）按照6∶1 比例混勻后，取50 μL 平鋪至Transwell小室（美國Corning公司）上層中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5 h 使基質(zhì)膠充分凝固。收集miR-425-5p mimics/inhibitor 組、mimics/inhibitor-NC組細(xì)胞后，以無血清DMEM 將細(xì)胞濃度調(diào)整為10個/毫升。在Transwell 小室上室中添加200 μL 細(xì)胞懸液，并在下室中加入600 μL 含血清DMEM。常規(guī)孵育24 h 后，以4% 多聚甲醛和0.1% 結(jié)晶紫對濾膜下的細(xì)胞進(jìn)行固定與染色。在顯微鏡下測量各組穿膜的海拉細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取隨機(jī)選取的3個視野細(xì)胞數(shù)的平均值。（2）遷移實驗：除了不需要以Matrigel基質(zhì)膠對Transwell 小室基底膜進(jìn)行包被外，其余步驟與侵襲實驗相同。后續(xù)pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTEN 組、siRNA-NC 組和siRNA-PTEN 組細(xì)胞侵襲和遷移能力的檢測方法同上。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測海拉細(xì)胞中磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達(dá)

以RIPA 裂解液（上海碧云天生物公司）獲取待測海拉細(xì)胞總蛋白。將100 ℃變性后的蛋白樣品上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（北京索萊寶生物公司）中行電泳分離后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜。以5% 脫脂奶粉封閉2 h后，加入PTEN 一抗（1∶1000，美國Abcam 公司）4 ℃下孵育24 h。再以辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2000）室溫孵育2 h 后，暗室中滴加ECL（上海碧云天生物公司）顯影曝光。在凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）中掃描并分析海拉細(xì)胞中PTEN 蛋白相對于內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-425-5p 和PTEN 的表達(dá)

將PTEN-3’非翻譯區(qū)（UTR）片段克隆重組至熒光素酶載體上來構(gòu)建PTEN 野生型（WT）載體質(zhì)粒，記為PTEN-WT 質(zhì)粒；另外，將miR-425-5p與PTEN-3’UTR 結(jié)合位點定點突變后克隆重組至熒光素酶載體上來構(gòu)建PTEN 突變型（MUT）載體質(zhì)粒，記為PTEN-MUT 質(zhì)粒。在24 孔細(xì)胞板接種將10個對數(shù)生長期的海拉細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)至80%融合度時，參照Lipofectamine2000 說明書，將PTEN-WT、PTEN-MUT 質(zhì)粒分別與miR-425-5p mimics/inhibitor 及其陰性對照共轉(zhuǎn)染至海拉細(xì)胞中，其中每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后依照熒光素酶活性檢測試劑盒（美國Promega 公司）隨附指南測量細(xì)胞的熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組海拉細(xì)胞中miR-425-5p 的表達(dá)水平

實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果表示，mimics-NC組（1.00±0.05）、miR-425-5p mimics 組（4.88±1.23）、inhibitor-NC 組（1.00±0.06）、miR-425-5p inhibitor 組（0.26±0.02）海拉細(xì)胞中miR-425-5p 的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=34.585，

P

＜0.001）。 與mimics-NC 組比較，miR-425-5p mimics 組明顯升高（

P

＜0.05）；與inhibitor-NC組比較，miR-425-5p inhibitor組明顯降低（

P

＜0.05）。

2.2 miR-425-5p 對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖的影響

MTT 法和平板克隆形成實驗檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-425-5p mimics 后海拉細(xì)胞存活率和克隆形成率均比mimics-NC 組明顯升高（

P

＜0.05）；但轉(zhuǎn)染miR-425-5p inhibitor 后海拉細(xì)胞存活率和克隆形成率均明顯低于inhibitor-NC 組（

P

＜0.05）。 見表1、圖1。

表1 各組細(xì)胞存活率和克隆形成率的比較/（%，±s）

圖1 各組宮頸癌海拉細(xì)胞克隆形成圖片 圖2 轉(zhuǎn)染miR-425-5p模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitor）的宮頸癌海拉細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞（結(jié)晶紫染色×200） 圖5 磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）表達(dá)對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響：5A為各組宮頸癌海拉細(xì)胞克隆形成圖片；5B為各組宮頸癌海拉細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞（結(jié)晶紫染色×200）

2.3 miR-425-5p 對宮頸癌海拉細(xì)胞侵襲和遷移的影響

Transwell 小室實驗檢測結(jié)果表示，miR-425-5p mimics 組中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均明顯高于mimics-NC 組，而miR-425-5p inhibitor 組中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均比inhibitor-NC 組明顯減少（

P

＜0.05）。見表2、圖2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-425-5p模擬物（mimics）/抑制劑（inhibitor）的細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)的比較/（個，±s）

2.4 miR-425-5p 靶基因預(yù)測及其驗證

生物信息學(xué)軟件TargetScan（http：//www.targetscan.org）預(yù)測結(jié)果見圖3A，miR-425-5p可靶向結(jié)合PTEN 3’UTR；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果見表3，相比于轉(zhuǎn)染mimics-NC，miR-425-5p mimics 可使PTEN-WT 的熒光素酶活性明顯降低（

P

＜0.05）；相較于轉(zhuǎn)染inhibitor-NC，miR-425-5p inhibitor 可使PTEN-WT 的熒光素酶活性明顯升高（

P

＜0.05）。同時，蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果圖3B、表3 所示，與各自陰性對照組比較，miR-425-5p mimics 可使海拉細(xì)胞中PTEN 蛋白表達(dá)水平明顯降低，而miR-425-5p 可使海拉細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平明顯升高（

P

＜0.05）。

圖3 miR-425-5p 和PTEN 靶向關(guān)系的驗證：A 為miR-425-5p 與PTEN 3’非翻譯區(qū)（UTR）存在互補(bǔ)的結(jié)合位點，B為蛋白質(zhì)印跡法檢測磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組細(xì)胞熒光素酶活性和磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達(dá)水平的比較/±s

2.5 PTEN 表達(dá)對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

將pcDNA3.1-PTEN 過表達(dá)質(zhì)粒和靶向PTEN 的小RNA 干擾序列siRNA-PTEN 轉(zhuǎn)染至海拉細(xì)胞后，進(jìn)一步觀察PTEN 表達(dá)對宮頸癌海拉細(xì)胞增殖和侵襲的影響，結(jié)果見圖4、圖5、表4。pcDNA3.1-PTEN 組細(xì)胞中PTEN 蛋白表達(dá)水平比pcDNA3.1 組高，而細(xì)胞存活率、克隆形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均比pcDNA3.1 組低（

P

＜0.05）；siRNA-PTEN組細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平低于siRNANC組，而細(xì)胞存活率、克隆形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均高于siRNA-NC組（

P

＜0.05）。

表4 各組中磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞存活率、克隆形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)的比較/±s

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細(xì)胞中磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

3.1 miR-425-5p促進(jìn)宮頸癌海拉細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移

miRNAs 是一類內(nèi)源性非編碼RNA，雖然只占人類基因的1%，但其已被證明與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-425-5p 是miRNAs 家族中的重要成員，在肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中的水平異常升高，且可通過對腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等過程的調(diào)節(jié)起促癌作用。例如：Quan 等在腎癌中發(fā)揮miR-425-5p 表達(dá)水平明顯上調(diào)，且具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和抑制細(xì)胞凋亡的作用，被認(rèn)為可能是腎癌發(fā)生發(fā)展過程中重要的致癌基因。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn)，miR-425-5p 高表達(dá)是導(dǎo)致前列腺癌惡性發(fā)展的重要機(jī)制，其作為促癌因子加速前列腺細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等過程。Wu 等報道，miR-425-5p 在肝癌的惡性進(jìn)展過程中發(fā)揮著積極作用，其可通過靶向調(diào)控FOXD3表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并阻止細(xì)胞凋亡。

miR-425-5p 在宮頸癌中存在著異常高表達(dá)，且其表達(dá)水平與病人不良預(yù)后密切相關(guān)；然而，miR-425-5p 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制并不完全清楚。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-425-5p inhibitor 成功下調(diào)miR-425-5p 表達(dá)后，MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)宮頸癌海拉細(xì)胞增殖活力明顯降低。該結(jié)論與Zhang 等通過MTT 法所得出的miR-425-5p 低表達(dá)可抑制宮頸癌海拉細(xì)胞增殖的結(jié)論相符。此外，本研究通過平板克隆形成實驗進(jìn)一步證實了下調(diào)miR-425-5p 表達(dá)具有抑制宮頸癌海拉細(xì)胞增殖的作用，上調(diào)miR-425-5p 表達(dá)可增強(qiáng)宮頸癌海拉細(xì)胞增殖能力。另外，本研究通過Transwell 小室實驗還檢測到，miR-425-5p 高表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌海拉細(xì)胞侵襲和遷移，而miR-425-5p 低表達(dá)可抑制宮頸癌海拉細(xì)胞侵襲和遷移。以上數(shù)據(jù)表明，miR-425-5 作為宮頸癌的促癌因子，通過影響宮頸癌的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移加速宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

3.2 靶向PTEN 是miR-425-5p 調(diào)節(jié)宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的重要機(jī)制

PTEN 是一個定位于10q23 染色體上的抑癌基因，可通過脂質(zhì)磷酸酶活性、蛋白磷酸酶活性和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路等影響細(xì)胞增殖、分化和遷移等過程，并參與宮頸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Peng 等研究指出，PTEN 在宮頸癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，且可被miR-301a 靶向調(diào)控影響宮頸癌細(xì)胞增殖。另外，Zhu 等研究指出，PTEN 是miR-641 下游靶基因，在miR-641 介導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移過程中發(fā)揮著重要的抑制作用。Xiao等在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)miR-425-5p可通過靶向調(diào)控PTEN 表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究證實，PTEN 是miR-425-5p 的靶基因。本研究轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTEN 過表達(dá)質(zhì)粒成功上調(diào)PTEN 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力明顯減弱；轉(zhuǎn)染PTEN-siRNA 成功下調(diào)PTEN 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，宮頸癌海拉細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)。結(jié)果表明，PTEN 對宮頸癌海拉細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移具有腫瘤抑制作用。

總之，本研究提供了新的證據(jù)，表明miR-425-5p 促進(jìn)宮頸癌惡性進(jìn)展的作用機(jī)制是通過靶向調(diào)控PTEN表達(dá)來實現(xiàn)的。這種新發(fā)現(xiàn)的miR-425-5p/PTEN 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)表明其有潛力成為未來宮頸癌病人的預(yù)后標(biāo)志物和有效靶點。

（本文圖1，2，5見插圖12-4）