非洲爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白2靶蛋白對非小細胞肺癌細胞遷移侵襲的影響及其機制

劉雷，施民新，陸海敏，王偉

目前，非小細胞肺癌的治療方法不斷取得進步，但非小細胞肺癌的療效依然不理想。術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是引起非小細胞肺癌療效不佳的主要原因。非小細胞肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移除了與臨床病理分期相關(guān)外，還涉及多種基因的變化。

在前期研究中，本課題組挖掘出一個在非小細胞肺癌中高表達并對預(yù)后判斷有指導(dǎo)意義的基因非洲爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白2 靶蛋白（TPX2）。TPX2是一個與中心體密切相關(guān)的蛋白，在腫瘤細胞染色體20q 經(jīng)常出現(xiàn)基因的擴增。此外，TPX2 也是一個微管相關(guān)蛋白，主要在細胞著絲粒處負責微管的組裝和形成。既往研究發(fā)現(xiàn)TPX2 在腎母細胞瘤和胃癌組織中均呈高表達水平，其過表達常提示預(yù)后不良。TPX2 可以通過激活A(yù)kt 信號通路進而促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移。鑒于TPX2基因作為一種促癌基因，其在非小細胞肺癌中高表達，且與病人預(yù)后密切相關(guān)。然而，其在非小細胞肺癌中的生物學(xué)功能還未詳細闡明。因此，本研究于2018年10月至2019年8月通過抑制TPX2 表達，觀察其對非小細胞肺癌細胞的遷移侵襲性及可能相互作用蛋白之間的影響，以明確TPX2 在非小細胞肺癌發(fā)展過程中的生物學(xué)功能及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640 培養(yǎng)液及新生牛血清購自杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司。蛋白裂解提取試劑和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce 公司。逆錄試劑盒和Gotaq 酶購自美國promega 公司。Trizol試劑、Lipofectamin 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）試劑盒購自美國invitrigen 公司。Transwell 培養(yǎng)板購自Corning 公司。TPX2、PI3K p85 抗體購自Abcam 公司?；|(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP12）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體及二抗購自Santa Cruz 公司。激活劑胰島素生長樣因子1（IGF-1）購自R&D System。非小細胞肺癌細胞A549 和H1299購自上海奧陸生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將細胞接種至含10% 胎牛血清和1% 雙抗的RMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達70%～80% 時，消化收集細胞用作后續(xù)實驗。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及分組

由上海吉瑪公司合成一對針對TPX2 基因的小干擾RNA（siRNA）和一對非特異性陰性對照的siRNA。前者序列：正向引物5’-UGCAGCAAGAGGUGGUGGATT-3’，反向引物3’-TTACGUCGUUCUCCACCACCU-5’；后者序列：正向引物5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反向引物3’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5’。于轉(zhuǎn)染前24 h，取對數(shù)生長期的非小細胞肺癌細胞A549和H1299分別接種于6 孔板中，使轉(zhuǎn)染實驗時細胞融合度達到70%。用Lipofectamine3000 將siRNA 轉(zhuǎn)入細胞。實驗分為三組：（1）空白對照組：未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞；（2）陰性對照組：轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA 的細胞；（3）siRNA-TPX2 組：轉(zhuǎn)染TPX2 特異性的siRNA的細胞。每組3個孔。

1.4 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測TPX2 mRNA 的表達

用Trizol 法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）后進行qRT-PCR 反應(yīng)。 TPX2 引物序列為：正向’-ATGGAACTGGAGGGCTTTTTC，反向’-TGTTGTCAACTGGTTTCAAAGGT，內(nèi)參GAPDH 引物序列為：正向’-GACATCAAGAAGGTGGTGAA，反向’-TGTCATACCAGGAAATGAGC。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2法計算TPX2 mRNA表達量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達

收集細胞，加入細胞裂解液，抽提蛋白后用BCA 法測定蛋白濃度。取50 μg 蛋白樣品進行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1.5 h，加入一抗（1∶100 稀釋），同時以GAPDH（1∶5000 稀釋）為內(nèi)參，4 ℃孵育過夜。用等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶5000 稀釋）室溫孵育1 h，再用TBST 洗膜3 次。用凝膠成像系統(tǒng)進行顯影。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖

各組細胞以1.0×10/mL 的密度接種于96 孔板，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱分別孵育24、48、72 h，并在每個時間點加入10 μL CCK-8溶液，置37C 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用酶標儀測定450 nm波長下各孔的吸光度。每組3個復(fù)孔。

1.7 細胞遷移實驗

將Transwell 小室套于24 孔板上。取細胞懸液100 μL（含1×10個細胞）加入Transwell 小室上室中，下室中加入500 μL 含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液。在37 ℃培養(yǎng)箱溫育36 h，用棉簽去除小室上層細胞，用結(jié)晶紫溶液室溫下染色后以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸洗。顯微鏡100 倍視野下計數(shù)移至微孔膜下層的細胞數(shù)目，每個樣本隨機選擇5個視野計數(shù)后取均值。

1.8 細胞侵襲實驗

將人工合成的基底膜材料Matrigel 膠用無血清培養(yǎng)液稀釋（體積1∶8）后，取60 μL 加于每個小室的膜上，4 ℃風干干燥。取細胞懸液100 μL（含1×10個細胞）加入Transwell小室上室中，下室中加入500 μL 含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液。37 ℃培養(yǎng)48 h。用棉簽擦去Matrigel 膠后，在室溫下用結(jié)晶紫溶液染色并用PBS浸洗。顯微鏡觀測計數(shù)同上。

2 結(jié)果

2.1 siRNA 干擾TPX2 對TPX2 的抑制作用

為了驗證干擾效果，本研究檢測了轉(zhuǎn)染siRNA-TPX2 后，A549 和H1299 細胞中TPX2 的mRNA 和蛋白表達情況。qRT-PCR 結(jié)果表明，與空白對照組及陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-TPX2后，A549和H1299細胞中TPX2的mRNA 表達顯著降低（

P

＜0.05），而空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。同時，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，siRNA-TPX2 顯著降低A549和H1299細胞中TPX2蛋白的表達。見表1。

表1 各組非小細胞肺癌A549、H1299細胞中TPX2（非洲爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白2靶蛋白）mRNA和蛋白相對表達量比較/±s

2.2 敲低TPX2 抑制非小細胞肺癌細胞增殖

CCK-8 細胞增殖實驗檢測轉(zhuǎn)染siRNA-TPX2 后，A549 和H1299 細胞的增殖能力變化情況。結(jié)果表明，與陰性對照組相比，TPX2 敲低可以顯著抑制A549和H1299細胞的增殖能力（

P

＜0.05），見表2。

表2 各組非小細胞肺癌A549、H1299細胞不同時間點吸光度（增殖能力）的比較/±s

2.3 敲低TPX2 抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲

為了評估TPX2敲低對A549細胞和H1299細胞的遷移和侵襲的影響，本研究通過Tanswell 小室實驗的方法檢測轉(zhuǎn)染siRNA-TPX2 后，A549 細胞和H1299 細胞的遷移和侵襲能力。與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-TPX2 后的A549 細胞和H1299 細胞的遷移和侵襲能力受到顯著抑制（

P

＜0.05），見表3。

表3 各組非小細胞肺癌A549、H1299細胞遷移和侵襲細胞數(shù)比較/（個，±s）

2.4 敲低TPX2 對PI3K/Akt 信號通路活性及侵襲相關(guān)分子MMPs 的影響

為進一步研究TPX2 促進非小細胞肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能分子機制，本研究通過蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染siRNA-TPX2 后，A549 和H1299 細胞中腫瘤侵襲相關(guān)分子MMP9 和MMP12 及PI3K/Akt 信號通路中的關(guān)鍵分子PI3K、Akt、p-Akt 的表達變化情況。蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，siRNA-TPX2 組A549 和H1299 細胞中MMP9 和MMP12 表達均顯著減少（

P

＜0.05）。同時，siRNA-TPX2 組A549 和H1299 細胞中的PI3K 及p-Akt 的蛋白表達顯著減少（

P

＜0.05），Akt蛋白無明顯變化（

P

＞0.05）。見表4。這些結(jié)果表明，TPX2可能通過激活PI3K/Akt信號通路及其下游的腫瘤侵襲相關(guān)分子MMP9 和MMP12 促進非小細胞肺癌細胞侵襲能力。

表4 各組非小細胞肺癌A549、H1299細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP12）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、蛋白激酶B（Akt）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白相對表達量比較/±s

為進一步驗證TPX2 主要是通過PI3K/Akt 信號通路調(diào)控MMP9 和MMP12 表達水平，在TPX2 被干擾的細胞中，本研究用PI3K/Akt 信號通路激動劑IGF-1 激活PI3K/Akt 信號通路。發(fā)現(xiàn)經(jīng)IGF-1（150 mg/L）處理后，能完全削弱TPX2-siRNA抑制A549和H1299 細胞中PI3K/Akt 信號通路活性及其下游MMP9 和MMP12 的表達，見表5。這提示TPX2 調(diào)控PI3K/Akt 信號通路活性及其下游MMP9 和MMP12的表達機制是TPX2 促進非小細胞肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制。

表5 各組非小細胞肺癌A549、H1299細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP12）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白相對表達量比較/±s

3 討論

TPX2蛋白為一種微管相關(guān)蛋白，由位于人類染色體20q11.1 中的基因編碼，主要參與紡錘體形成和微管成核。最初由Heidebrecht 于1977年鑒定發(fā)現(xiàn)，并被揭示為與增殖相關(guān)的核蛋白。目前，更多研究探討了TPX2 與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。TPX2的過表達與宮頸癌、食管鱗癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。本課題組先前的研究也發(fā)現(xiàn)TPX2 在非小細胞肺癌組織中高表達，并且TPX2 高表達是非小細胞肺癌病人預(yù)后不良獨立的風險因素。Schneider 等研究發(fā)現(xiàn)，TPX2 基因在非小細胞肺癌中存在過表達，同時TPX2 的表達可作為預(yù)測非小細胞肺癌預(yù)后的重要工具。這些研究結(jié)果表明，TPX2可以作為一個致癌基因參與非小細胞肺癌的發(fā)展。然而，TPX2在非小細胞肺癌發(fā)展中所發(fā)揮的生物學(xué)功能目前尚不明確。本研究通過采用RNAi 技術(shù)，實驗驗證結(jié)果表明A549 和H1299 細胞內(nèi)源性TPX2 基因受抑制，成功構(gòu)建了TPX2 siRNA 細胞模型，為進一步闡明TPX2 在非小細胞肺癌中的功能提供理想的研究平臺。

近年來，不少研究發(fā)現(xiàn)TPX2 的過表達促進了人類不同惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，TPX2的表達水平與腫瘤惡性程度，遠處轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。過量表達TPX2 可導(dǎo)致DNA 非整倍性和多倍體，TPX2的異常表達可抑制正常有絲分裂并導(dǎo)致癌變。RNA 干擾介導(dǎo)的TPX2 下調(diào)可抑制胰腺癌Sw480 細胞和Hela 細胞的生長和侵襲能力。同時，下調(diào)TPX2 的表達能顯著抑制接種肝癌細胞的免疫缺陷的小鼠腫瘤的增殖能力。這些研究結(jié)果充分表明敲低TPX2 的表達能抑制腫瘤的增殖。本研究顯示，降低TPX2 的表達能顯著抑制A549 和H1299 細胞的增殖能力。Tanswell 小室實驗結(jié)果提示轉(zhuǎn)染TPX2-siRNA 組穿膜細胞數(shù)顯著減少，表明抑制TPX2 基因的表達能引起非小細胞肺癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移能力下降。這些結(jié)果表明TPX2 可以作為非小細胞肺癌潛在的抗腫瘤靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)通過siRNA 下調(diào)TPX2 的表達能引起A549 和H1299 細胞中MMP9 和MMP12 蛋白表達受到抑制。MMP9 和MMP12 可作為非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要因子。這些研究結(jié)果表明TPX2 可能通過調(diào)節(jié)MMP9 和MMP12 的表達進而促進非小細胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。最近，一些研究表明PI3K/Akt 信號通路在上調(diào)MMP 表達中發(fā)揮重要作用。異常Akt 信號通路可抑制非小細胞肺癌細胞凋亡，促進細胞增殖。此外，有報道稱Akt信號通路可通過促進MMP2 和MMP9 的表達，在非小細胞肺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TPX2 通過激活A(yù)kt 信號通路調(diào)節(jié)MMP2 促進膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲。在肝細胞肝癌中，TPX2 表達與MMP2 和MMP9 呈正相關(guān)，體外研究發(fā)現(xiàn)TPX2 敲低顯著減低細胞侵襲和遷移能力，并降低MHCC-97H 細胞中磷酸化的Akt，MMP2 和MMP9 表達。至于非小細胞肺癌中，本研究發(fā)現(xiàn)TPX2 表達下調(diào)后，PI3K/Akt 信號通路中的PI3K、p-Akt 表達明顯受到抑制，而使用激動劑IGF-1 激活PI3K/Akt 信號通路后，其下游的侵襲相關(guān)分子MMP9 和MMP12 的抑制效應(yīng)明顯消除。這些研究結(jié)果表明TPX2 也可能是通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)MMPs的表達影響非小細胞肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，TPX2表達下調(diào)可抑制非小細胞肺癌A549 和H1299 細胞增殖、遷移及侵襲能力。TPX2調(diào)控PI3K/Akt 信號通路活性及其下游MMP9 和MMP12的表達機制是TPX2促進非小細胞肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制。