微小RNA-374a靶向脾酪氨酸激酶對卵巢癌細胞放射敏感性及遷移、侵襲的影響

李娜，榮金鳳，徐艷

卵巢癌是威脅女性健康的惡性腫瘤之一，其早期發(fā)病較為隱匿且極易出現擴散及轉移，調查顯示卵巢癌病人5年生存率較低。目前臨床采用手術結合放化療等手段治療卵巢癌，但腫瘤細胞對放射治療極易產生耐受性而降低治療效果。因而如何提高腫瘤細胞放射敏感性成為重點研究問題。miRNA 異常表達可通過誘導細胞凋亡而增強腫瘤細胞放射敏感性。因而積極尋找與卵巢癌發(fā)生及轉移相關的分子靶點對提高細胞放射敏感性具有重要意義。研究表明微小RNA-374a（miR-374a）在卵巢癌中上調表達并可降低細胞對順鉑的敏感性。但miR-374a對卵巢癌放射敏感性的影響尚未可知。TargetScan預測顯示脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）可能是miR-374a 的靶基因，研究表明Syk 低表達與卵巢癌病人臨床病理特征相關。本研究探討miR-374a 對卵巢癌細胞遷移及侵襲的影響及其與放射敏感性的關系，初步分析miR-374a 對Syk 的靶向調控作用，試圖闡明miR-374a 在卵巢癌發(fā)展及治療中的作用機制，旨在為卵巢癌放射治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2017年2月至2018年1月在宜賓市第二人民醫(yī)院接受治療的63 例卵巢癌病人為研究對象，所有病人均接受手術切除治療。以卵巢癌癌旁組織為對照，術中切除卵巢癌組織及癌旁組織，病人年齡（65.85±3.87）歲，范圍為50～70 歲。本研究符合《世界醫(yī)學協會赫爾辛基宣言》相關要求，入組病人知情且簽署同意書。

1.2 材料與試劑

卵巢癌A2780 細胞購自美國ATCC 公司。Trizol 試劑購自北京嘉美紐諾生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；miR-374a特異性寡核苷酸抑制劑（antimiR-374a）及陰性對照（anti-miR-NC）、Syk 小干擾RNA（si-Syk）與陰性對照si-NC 均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購自美國Thermo Fisher 公司；Transwell 小室與Matrigel 基質膠均購自美國BD公司；噻唑藍（MTT）細胞增殖檢測試劑盒購自上?；鶢栴D生物科技有限公司；兔抗人細胞周期蛋白1（cyclin D1）、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（cell cycle dependent protein kinase inhibitor 1A，P21）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）購自上海碧云天生物技術有限公司；上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體購自美國R&D Systems 公司；逆轉錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1

實驗處理與分組 A2780細胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱環(huán)境條件為37 ℃、5% 二氧化碳體積分數、相對濕度95%。細胞80% 融合時進行傳代培養(yǎng)。收集對數生長期細胞進行轉染，以隨機數字表法分成anti-miR-NC 組（細胞中轉染anti-miR-NC）、anti-miR-374a 組（細胞中轉染anti-miR-374a）、anti-miR-374a+si-NC 組（細胞中共轉染anti-miR-374a 與si-NC）、anti-miR-374a+si-Syk 組（細胞中共轉染anti-miR-374a 與si-Syk），轉染步驟參照Lipofectamine2000 說明書。收集轉染48 h細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.2

實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測miR-374a 表達 取凍存卵巢癌及癌旁組織冰上溶解，分別加入Trizol 試劑提取總RNA（各組卵巢癌A2780 細胞復蘇后加入Trizol 試劑），利用Nanodrop2000c 超微量分光光度計檢測RNA 濃度，加入無核糖核酸酶水稀釋RNA（50 mg/L），參照逆轉錄試劑盒合成互補DNA（cDNA），據SYBR? Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒配置反應體系進行qRT-PCR。2算法計算miR-374a相對表達量。

1.3.3

MTT 法檢測細胞增殖 取對數生長期A2780細胞接種于96孔板（3×10個/孔），分別于轉染24 h、48 h、72 h 時向各孔添加20 μL MTT 溶液，孵育4 h后，棄上清，依次150 μL 二甲基亞砜，低速振蕩至結晶溶解。酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度。

1.3.4

Transwell 實驗檢測細胞遷移與侵襲 侵襲實驗：將稀釋的Matrigel平鋪于上室，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育5 h，取各組A2780 細胞接種于上室（5×10個/孔），取600 μL含血清培養(yǎng)液接種下室。孵育24 h后，多聚甲醛固侵襲細胞，結晶紫染液染色。顯微鏡下計數侵襲細胞數。以未經Matrigel 基質膠包裹的小室進行遷移實驗，其余步驟參考侵襲實驗。

1.3.5

克隆形成實驗檢測細胞敏感性 anti-miRNC 組、anti-miR-374a 組、anti-miR-374a+si-NC 組、anti-miR-374a+si-Syk 組細胞經0、2、4、6、8 Gy 照射劑量射線照射（劑量率0.36 Gy/min），收集放射處理的細胞，0.25% 胰蛋白酶消化細胞，計數后接種于24孔培養(yǎng)皿中（3×10個/毫升），分別加入DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)10～15 d，棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌，甲醇固定后進行結晶紫染色。計算細胞存活分數，參照單擊多靶模型計算細胞放射增敏比。

1.3.6

雙熒光素酶報告基因實驗 將含有結合位點Syk 的3’非翻譯區(qū)（UTR）序列及突變位點的Syk的3’UTR 序列別插入pGL3 載體分別構建成WTSyk、MUT-Syk 重組載體，分別將重組載體與miR-374a mimics、miR-NC 共轉染至卵巢癌A2780 細胞，實驗分組分成miR-NC 組（WT-Syk）、miR-374a 組（WT-Syk）、miR-NC 組（MUT-Syk）、miR-374a 組（MUT-Syk），收集培養(yǎng)48 h細胞檢測熒光素酶活性。

1.3.7

蛋白質印跡法（Western blotting）檢測Syk、cyclin D1、MMP-2、P21、E-cadherin 蛋白表達 提取A2780 細胞總蛋白，按照蛋白變性→十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳→轉聚偏二氟乙烯膜→封閉膜→一抗稀釋液（1∶1000）孵育→二抗稀釋液（1∶2000）孵育→化學發(fā)光顯色步驟進行。ImageJ 軟件分析各條帶相對于內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）條帶灰度值。

2 結果

2.1 miR-374a 在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達

卵巢癌組織中miR-374a 的表達水平（0.92±0.09）高于癌旁組織（0.28±0.03）（

t

=53.546，

P

＜0.001）。

2.2 抑制miR-374a 表達對細胞A2780 生物學行為及放射敏感性的影響

anti-miR-374a 組卵巢癌A2780 細胞遷移與侵襲數、cyclin D1 和MMP-2 蛋白表達、增殖活力低于anti-miR-NC 組（

P

＜0.05），P21、E-cadherin 蛋白表達水平高于anti-miR-NC 組（

P

＜0.05），見圖1、圖2、表1、表2。anti-miR-374a 組卵巢癌A2780 細胞存活分數低于anti-miR-NC 組（

P

＜0.05），增敏比明顯高于anti-miR-NC組，見表3，4。

圖2 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

表1 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780增殖的影響/±s

表2 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780遷移、侵襲的影響/±s

表3 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780存活分數的影響/±s

圖1 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780遷移、侵襲的影響（結晶紫染色×200）

2.3 miR-374a 靶向、調控Syk

TargetScan 預測顯示Syk 的3’UTR 含有miR-374a 的結合位點，見圖3。與miR-NC 組（WT-Syk）比較（0.99±0.10），miR-374a組（WT-Syk）熒光素酶活性降低（0.22±0.02）（

t

=18.495，

P

＜0.001）；而miR-NC 組（MUT-Syk）（1.03±0.10）熒光素酶活性與miR-374a 組（MUT-Syk）（0.96±0.10）比較差異無統(tǒng)計學意義（

t

=1.212，

P

=0.253）。

圖3 TargetScan預測脾酪氨酸激酶（Syk）的3’UTR與miR-374a的結合位點

表4 細胞放射增敏比單擊多靶模型參數

miR-NC 組、miR-374a 組、anti-miR-NC 組、antimiR-374a 組卵巢癌A2780 細胞中Syk 的表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（

F

=294.889，

P

＜0.001），miR-374a 組（0.07±0.01）低于miR-NC 組（0.26±0.02）（

P

＜0.05），anti-miR-374a組（0.63±0.06）高于anti-miR-NC組（0.25±0.02）（

P

＜0.05），見圖4。

圖4 過表達miR-374a或抑制miR-374a表達對Syk蛋白表達的影響

2.4 抑制Syk 表達能逆轉抑制miR-374a 表達對細胞A2780 放射敏感性的影響

相較于anti-miR-374a+si-NC 組，anti-miR-374a+si-Syk 組卵巢癌A2780 細胞存活分數升高（

P

＜0.05），增敏比明顯降低，見表5，6。

表5 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780存活分數的影響/±s

表6 細胞放射增敏比單擊多靶模型參數

2.5 抑制Syk 表達能逆轉抑制miR-374a 表達對細胞A2780 生物學行為的影響

anti-miR-374a+si-Syk組卵巢癌A2780 細胞活力、cyclin D1 和MMP-2 蛋白表達、遷移與侵襲數高于anti-miR-374a+si-NC 組（

P

＜0.05），P21 和E-cadherin 蛋白表達低于anti-miR-374a+si-NC組（

P

＜0.05），見圖5、表7、表8。

表7 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780增殖的影響/±s

表8 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780遷移、侵襲的影響/±s

圖5 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討論

卵巢癌病人在治療期間易出現耐藥、轉移等導致病人預后不良，但關于卵巢癌發(fā)病機制仍需深入研究。卵巢癌晚期病人主要采用放療進行治療，其主要通過抑制或殺傷腫瘤細胞而發(fā)揮作用，但治療過程中病人常出現輻射敏感等現象，進一步研究顯示miRNA 表達水平與腫瘤細胞生長及治療密切相關。但miRNA 在卵巢癌細胞放射抵抗中的調控作用尚未完全闡明。

miR-374a 在非小細胞肺癌病人血清中的表達水平升高，并可能成為臨床診斷非小細胞肺癌的輔助指標。研究表明miR-374a 高表達與宮頸癌病人淋巴結轉移等臨床病理特征有關。miR-374a-5p可通過靶向SPIN1而降低食管鱗狀細胞癌對放療的敏感性。本研究結果顯示miR-374a 在卵巢癌組織中的表達水平高于癌旁組織，抑制miR-374a 表達可提高卵巢癌細胞對放射的敏感性。進一步研究顯示抑制miR-374a 表達可降低卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，通過蛋白質印跡法證實抑制miR-374a 表達可促進P21、E-cadherin 表達，抑制cyclin D1、MMP-2 表達，另有研究報道指出cyclin D1 可通過與CDK 結合形成復合物進而調控細胞增殖及分裂導致腫瘤發(fā)生，P21 可抑制cyclin D1 與CDK 結合形成復合物從而抑制腫瘤細胞惡性進展。研究表明MMP-2 在卵巢癌組織中高表達并可促進細胞遷移及侵襲，E-cadherin 表達減少可促進腫瘤細胞浸潤擴散。本研究證實抑制miR-374a 表達可減弱卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。

Syk基因可調控B淋巴細胞的多種生物學過程，研究表明Syk 基因在結腸癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤中呈低表達，并可在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用。Syk可改變膠質瘤微環(huán)境，影響膠質瘤細胞增殖及遷移。本研究試圖分析miR-374a 與Syk 在卵巢癌細胞生長、轉移及放射敏感性中的作用關系，結果表明miR-374a 可負向調控Syk的表達，且聯合抑制miR-374a和Syk表達后，卵巢癌細胞活力增強，遷移與侵襲細胞數增多，提示miR-374a 通過靶向Syk 來抑制卵巢癌細胞生物學行為，增強細胞放射敏感性。

綜上，miR-374a 表達水平降低可增強卵巢癌細胞放射敏感性，其作用機制可能是通過上調Syk 表達降低卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力而實現，可為卵巢癌放射治療提供新方向。

（本文圖1見插圖12-3）