鹽酸納美芬對(duì)心肌缺血再灌注大鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α/B 細(xì)胞淋巴瘤-2/E1B-19kDa相互作用蛋白3通路及心肌自噬的影響

趙紅霞，孟麗華，騰云鵬

隨著冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)對(duì)缺血性心臟病治療中的廣泛應(yīng)用，缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷成為治療中的熱點(diǎn)問題，而自噬是參與心肌I/R 損傷的重要病理生理機(jī)制，除非有誘發(fā)因素（如外界營養(yǎng)成分、缺血缺氧、生長因子濃度等，內(nèi)在損壞的線粒體、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)病原體等）的存在，否則在正常情況下，自噬很少發(fā)生。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，Hif-1α）/B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）/E1B-19kDa 相互作用蛋白3（Bcl-2 and adenovirus E1B19kDa-interacting protein 3，BNIP3）信號(hào)通路是低氧條件下發(fā)生自噬的重要信號(hào)通路，其中BNIP3是一種促凋亡蛋白，可誘導(dǎo)線粒體功能障礙，是I/R 損傷的重要因素。抑制低氧誘導(dǎo)的Hif-1α 和BNIP3 水平，可進(jìn)一步抑制低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬和凋亡作用，發(fā)揮心肌保護(hù)功能。而鹽酸納美芬不但可劑量依賴性地減輕大鼠肺I/R損傷，而且對(duì)治療新生兒缺氧缺血性腦病的效果顯著，可明顯改善患兒癥狀，同時(shí)安全性較高。但是鹽酸納美芬對(duì)心肌I/R 損傷大鼠Hif-1α/BNIP3 通路及心肌自噬的影響，目前尚未有研究。本研究于2020年3—4月通過采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支法復(fù)制心肌缺血再灌注損傷（myocardial Ischemia reperfusion injury，MIRI）大鼠模型，并使用鹽酸納美芬干預(yù)該模型，旨在從基礎(chǔ)研究領(lǐng)域揭示鹽酸納美芬對(duì)MIRI大鼠Hif-1α/BNIP3通路及心肌自噬的影響，為缺血性心臟病病人的治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)6～7 周齡SD 大鼠（90 只，雄性，體質(zhì)量范圍為200～220 g）購自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（渝）2018-0003，符合國家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定。按照3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷照顧。飼養(yǎng)條件為：自由攝水、飲食，恒溫22 ℃，相對(duì)濕度55%，12 h光暗循環(huán)，定期添加飼料、飲用水、更換墊料、清理消毒鼠籠，保持動(dòng)物房通風(fēng)、清潔、安靜。

1.1.2

實(shí)驗(yàn)藥物 鹽酸納美芬（規(guī)格：1 mL×5 支，批次1812010，批號(hào)H20183012）購自成都苑東生物制藥股份有限公司；氯喹（規(guī)格：50 mg，純度：97%）為一種自噬抑制藥物且能緩解心肌損傷，購自麥克林生化科技有限公司。

1.1.3

主要試劑和儀器 十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）鼠抗均購自美國Sigma 公司；蛋白提取試劑盒、ECL 顯色試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒購自北京中山金橋生物科技有限公司；4% 多聚甲醛購自武漢塞維爾生物科技有限公司；氯化三苯基四氮唑（2、3、5-Triphenyte-trazoliumchloride，TTC）染液、蘇木素和伊紅染液均購自上海生工生物科技有限公司；二氯熒光素雙醋酸鹽（DCFH-DA）活性氧檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Hif-1α、BNIP3 兔抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗均購自美國Abcam 公司；動(dòng)物心電圖分析系統(tǒng)和小動(dòng)物呼吸機(jī)均購自上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司；尼康SMZ745 光學(xué)顯微鏡購自于上海普赫生物科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP 購自山東三瑞科技有限公司；石蠟切片機(jī)購自湖北惠達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1

MIRI 模型的建立及分組 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)。進(jìn)行術(shù)前心電圖檢查，取心電圖正常且符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠進(jìn)行造模，采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支法復(fù)制MIRI 大鼠模型。大鼠四肢接心電圖監(jiān)護(hù)電極監(jiān)測(cè)心電圖變化，經(jīng)口腔氣管插管后，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)（設(shè)定為室內(nèi)空氣氣源，呼吸頻率70 次/分，潮氣量11～14 mL），然后剔除大鼠頸前區(qū)和胸前區(qū)毛發(fā)，皮膚進(jìn)行消毒后，沿胸骨正中線左側(cè)旁開約0.5 cm 處切開皮膚，在第3、4 肋骨間開胸，暴露心臟，輕輕挑開心膜，撥開左心耳，緩慢分離出左冠狀動(dòng)脈前降支，使用6/0 無損傷縫線結(jié)扎血管（假手術(shù)組僅暴露心臟，不做其他處理）。觀測(cè)心電圖變化，當(dāng)ST波升高，心肌顏色由紅變白時(shí)，表明缺血完成，維持30 min 后，松開結(jié)扎線，恢復(fù)左前降支血液灌注，心電圖顯示ST 波下降且出現(xiàn)病理性Q 波，表示MIRI 大鼠模型建造成功。依次進(jìn)行肌肉、皮膚的縫合，并于切口處擦拭少量碘伏消毒，防止感染。將造模成功的75 只大鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、鹽酸納美芬低、中、高（大鼠尾靜脈注射10 μg/kg、15 μg/kg、20 μg/kg鹽酸納美芬）劑量組、氯喹組（陽性對(duì)照，大鼠腹腔注射0.02 g/kg），每組15 只，另取15只假手術(shù)組大鼠作為對(duì)照，模型組和假手術(shù)組尾靜脈及腹腔注射等劑量生理鹽水，其余各組給予相對(duì)應(yīng)劑量藥物，每天1次，連續(xù)3 d。

1.2.2

實(shí)驗(yàn)樣本的獲取和保存 給藥結(jié)束24 h 后，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛（400 mg/kg）深度麻醉實(shí)施安樂死。迅速解剖，分離心臟，各組分別取5只大鼠心臟置于-20 ℃冰箱中冷凍、5只大鼠心肌組織置于4% 多聚甲醛固定、5 只大鼠心肌組織置于-80 ℃超低溫冰箱待用。

1.2.3

TTC法檢測(cè)各組大鼠心肌梗死面積 取上述“1.2.2”中置于-20 ℃冰箱中冷凍2 h 的心臟，使用超薄特制刀片橫向切割左心室。厚度均勻的切成5～6片，并將切片置于1% TTC 溶液中，37 ℃水浴20 min（為使染色均勻，第10分鐘時(shí)需進(jìn)行翻面），然后使用預(yù)冷的生理鹽水洗取多余染液。將標(biāo)本依次進(jìn)行拍照，采用Image pro 軟件分析非梗死區(qū)（紅色）和梗死區(qū)（白色）面積。計(jì)算公式為：心肌梗死面積=心肌梗死區(qū)面積/心肌總面積×100%。

1.2.4

蘇木精-伊紅（HE）染色觀察各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化 取上述“1.2.2”中置于4% 多聚甲醛中固定24 h 的心肌組織，石蠟包埋，冷凍切片機(jī)將組織切成厚度約為4 μm的切片（為防止染色過程中組織切片脫落，需在65℃下拷片2 h），置于二甲苯中脫蠟2 次，每次10 min，依次使用100%、95%、85%、75% 的梯度乙醇脫水，每次5 min，然后使用蘇木素染色15 min、流水沖洗2 min、1% 鹽酸乙醇分化2 s、流水沖洗15 min、伊紅染色10 min、再依次使用80%、85%、95%、100% 乙醇脫水，每次5 min、二甲苯透明2 次，每次10 min，最后在石蠟切片正中滴加適量中性樹膠封固，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝照片。

1.2.5

DCFH-DA 法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中活性氧水平 取上述“1.2.2”中置于-80 ℃超低溫冰箱中的各組大鼠心肌組織，分別稱取1.5 g 加入3 mL 100 mmol/L 磷酸緩沖液制備組織勻漿，然后4 ℃，1000 r/min 離心10 min，取上清待用，依據(jù)DCFHDA試劑盒說明書于96孔板內(nèi)加入190 μL勻漿上清和10 μL 1 mmol/L DCFH-DA 工作液，用移液槍吹打混勻，37 ℃孵育30 min 后，于熒光酶標(biāo)儀下，設(shè)置激發(fā)波長500 nm、發(fā)射波長525 nm，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，即為活性氧相對(duì)水平。

1.2.6

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組大鼠心肌組織中通路蛋白Hif-1α、BNIP3 及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取上述“1.2.2”中置于-80 ℃超低溫冰箱中的各組大鼠剩余心肌組織，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、5% 脫脂奶粉封閉、1∶2000 濃度稀釋后的Hif-1α、BNIP3、Beclin-1 和GAPDH 鼠抗4 ℃過夜孵育、置于含辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶5000）中室溫孵育2 h，用ECL 顯色試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)水平，計(jì)算各蛋白相對(duì)內(nèi)參蛋白GAPDH的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸納美芬對(duì)MIRI 大鼠心肌梗死面積的影響

與假手術(shù)組大鼠心肌梗死面積（0.00±0.00）%相比，模型組大鼠心肌梗死面積（49.25±5.06）%顯著升高（

P

＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬低、中、高劑量組大鼠心肌梗死面積分別為（22.07±2.48）%、（13.31±1.69）% 、（4.26±0.52）% ，依次降低（

P

＜0.05）；氯喹組大鼠心肌梗死面積為（3.67±0.39）%，與鹽酸納美芬高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

F

=290.049，

P

＜0.001。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織TTC染色情況：1A為假手術(shù)組；1B為模型組；1C為鹽酸納美芬低劑量組；1D為鹽酸納美芬中劑量組；1E為鹽酸納美芬高劑量組；1F為氯喹組 圖2 各組大鼠心肌組織病理變化（HE染色×200）：2A為假手術(shù)組；2B為模型組；2C為鹽酸納美芬低劑量組；2D為鹽酸納美芬中劑量組；2E為鹽酸納美芬高劑量組；2F為氯喹組

2.2 鹽酸納美芬對(duì)MIRI大鼠心肌組織病理變化的影響

假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯病理變化。模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)異常、心肌細(xì)胞壞死、心肌損傷嚴(yán)重。與模型組相比，鹽酸納美芬低、中、高劑量組大鼠心肌組織病理損傷依次減輕，且鹽酸納美芬高劑量組和氯喹組差別不明顯。見圖2。

2.3 鹽酸納美芬對(duì)MIRI大鼠心肌組織中活性氧水平的影響

與假手術(shù)組大鼠心肌組織活性氧水平0.15±0.02 相比，模型組大鼠心肌組織中活性氧水平0.87±0.09 顯著升高（

P

＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬低、中、高劑量組大鼠心肌組織活性氧水平分別為0.52±0.06、0.39±0.05、0.22±0.04，依次降低（

P

＜0.05）；氯喹組大鼠心肌組織活性氧水平為0.20±0.03，與鹽酸納美芬高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

F

=129.784，

P

＜0.001。

2.4 鹽酸納美芬對(duì)MIRI大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著增加（

P

＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬低、中、高劑量組大鼠心肌組織中Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值依次降低（

P

＜0.05）；鹽酸納美芬高劑量組和氯喹組大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P ＞

0.05）。各組間LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P ＞

0.05）。見圖3、表1。

表1 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值比較/±s

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5 鹽酸納美芬對(duì)MIRI大鼠心肌組織中通路蛋白Hif-1

α

、BNIP3表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中Hif-1α、BNIP3 蛋白表達(dá)水平顯著增加（

P

＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬低、中、高劑量組大鼠心肌組織中Hif-1α、BNIP3 蛋白表達(dá)水平依次降低（

P

＜0.05）；鹽酸納美芬高劑量組和氯喹組大鼠心肌組織中Hif-1α、BNIP3 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P ＞

0.05）。 見圖4、表2。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Hif-1α、BNIP3蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠心肌組織中Hif-1α、BNIP3蛋白表達(dá)水平比較/±s

3 討論

心肌梗死的發(fā)生發(fā)展過程迅速，可使心肌組織大面積損傷，若不及時(shí)治療，很容易導(dǎo)致死亡，進(jìn)行相應(yīng)治療后，可恢復(fù)心肌血液供應(yīng)，但極易引起MIRI，進(jìn)而導(dǎo)致心功能障礙，使病人預(yù)后不良，且隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)生和人民生活習(xí)慣的改變，我國居民心肌梗死發(fā)病率逐年上升，所以尋找新的MIRI治療藥物及手段已成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。本研究采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支法構(gòu)建MIRI 大鼠模型后，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)異常、心肌細(xì)胞壞死、心肌損傷嚴(yán)重、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高，提示模型構(gòu)建成功，且伴隨心肌自噬。

鹽酸納美芬主要用于完全或部分逆轉(zhuǎn)阿片類藥物過量引起的中毒，還可用于治療促醒、急性顱腦與脊髓損傷、腦缺血、昏迷、休克、術(shù)后麻醉催醒、酒精中毒等。隨著對(duì)其作用的不斷研究，研究發(fā)現(xiàn)給予膿毒性休克病人鹽酸納美芬干預(yù)治療后，可明顯減輕病人心肌損傷程度。本研究中，鹽酸納美芬各組大鼠心肌組織病理損傷較模型組減輕，心肌梗死面積較模型組降低，與臨床研究相似。另外，研究發(fā)現(xiàn)抑制心肌過度自噬可緩解MIRI，發(fā)揮心肌保護(hù)作用柴松波等，而過量活性氧可以通過凋亡和自噬機(jī)制觸發(fā)細(xì)胞程序性死亡。但是另有Cao 等研究發(fā)現(xiàn)生脈注射液可通過Beclin-1 的表達(dá)，促進(jìn)心肌線粒體自噬，對(duì)感染性心肌病心肌線粒體具有保護(hù)作用，與上述Wu 等研究結(jié)果并不一致。這可能是由于自噬是一把“雙刃劍”，同時(shí)自噬過程較快，而且細(xì)胞自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常復(fù)雜，并且來自外界的多種刺激條件及環(huán)境因素各不相同，所以不同細(xì)胞和組織間的自噬活性存在一定的差異性。而本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，鹽酸納美芬低、中、高劑量組大鼠心肌組織活性氧水平以及Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值依次降低，提示鹽酸納美芬可劑量依賴性地降低心肌自噬及氧化因子水平，與上述Wu 等研究結(jié)果一致，但其中的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

HIF-1α/BNIP3 信號(hào)通路是參與心肌自噬的重要通路，且與MIRI的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。低氧可通過Hif-1α 依賴的信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞存活，并通過誘導(dǎo)BNIP3 表達(dá)增強(qiáng)心肌細(xì)胞自噬和凋亡。自噬小體的形成或清除缺陷可引起心功能障礙，甚至導(dǎo)致心力衰竭，而MIRI 可增加Hif-1α 的表達(dá)水平，激活下游BNIP3表達(dá)，進(jìn)而觸發(fā)線粒體依賴的自噬，上調(diào)Hif-1α 和BNIP3表達(dá)可促進(jìn)心肌I/R大鼠心肌細(xì)胞的自噬。另有王睿等研究發(fā)現(xiàn)地馬煎劑可通過激活HIF-1α/BNIP3/Beclin-1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，提高潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸上皮的線粒體自噬水平。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌組織中Hif-1α 和BNIP3 蛋白表達(dá)水平顯著升高，經(jīng)低、中、高劑量鹽酸納美芬干預(yù)后，Hif-1α 和BNIP3 蛋白表達(dá)水平依次降低，提示鹽酸納美芬可劑量依賴性地抑制Hif-1α/BNIP3通路，降低MIRI大鼠心肌自噬。

綜上所述，鹽酸納美芬可能通過抑制Hif-1α/BNIP3 通路，降低MIRI 大鼠心肌自噬，緩解心肌損傷，且呈劑量依賴性。但是鹽酸納美芬對(duì)MIRI的治療機(jī)制較為復(fù)雜，尚需深入研究。

（本文圖1，2見插圖12-1）