星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化杜仲漂浮型脈沖釋放片處方的研究

耿燕娜，常杰，婁婷婷，尹元元，武毅君

杜仲葉為杜仲科植物杜仲

Eucommia ulmoides Oliv

的干燥葉。其功能主治為：補肝腎，強筋骨?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第11冊收載有杜仲平壓片，主要成分為杜仲葉提取物，適用于高血壓，頭暈?zāi)垦?，腰膝酸痛，筋骨萎軟等，是理想的中藥降壓藥物。漂浮型脈沖釋藥系統(tǒng)是將胃滯留和脈沖釋藥原理相結(jié)合，延長制劑在消化道的滯留時間，保證藥物的釋放和吸收。高血壓病人的血壓峰值在早晨6—9點，是具有晝夜節(jié)律特性的一類疾病，目前上市的含杜仲葉成分降壓藥有杜仲平壓片，文獻報道有杜仲葉提取物滴丸，是普通藥物劑型，治療存在一定局限性。根據(jù)時辰藥理學(xué)原理，按生物時間節(jié)律特點設(shè)計的杜仲漂浮型脈沖釋放片，可在病人方便時服藥，在病人血壓高時釋藥，提高治療效果和病人依從性。

本研究前期已確定了片芯處方，通過單因素實驗考察了包衣處方、壓片壓力等因素對制劑體外釋藥及漂浮性能的影響。本研究于2018年1—12月在單因素實驗的基礎(chǔ)上以釋藥時滯和起漂時間為評價指標(biāo)，選取外層包衣層中羥丙甲纖維素（HPMC）、乳糖、碳酸氫鈉含量的百分比為考察因素，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化最佳處方，工藝穩(wěn)定可靠，合理可行，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)與臨床需求，為杜仲漂浮型脈沖釋放片的進一步體內(nèi)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2600 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；ZRS-8GD 型智能溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；ZP8 旋轉(zhuǎn)式壓片機（上海天和制藥機械有限公司）；TG16臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；ME104 電子天平[梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司，最小稱量0.1 mg］；PS-2060 型秒表（深圳市追日電子科技有限公司）。

1.2 試藥

杜仲葉提取物（實驗室自制，杜仲葉由河南省靈寶市中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心杜仲研究基地提供，經(jīng)河南大學(xué)藥學(xué)院李欽教授鑒定為杜仲科植物杜仲

Eucommia ulmoides Oliv

的干燥葉）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110753-200212）；HPMC（湖州展望藥業(yè)有限公司，批號20170903）；碳酸氫鈉（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司，批號20160804）；乳糖（生產(chǎn)商：德國美劑樂集團上海代表處，批號L1406A）。

2 方法與結(jié)果

2.1 杜仲漂浮型脈沖釋放片的制備

將杜仲葉提取物與各輔料均勻混合，加入適量的微粉硅膠，使用7 mm 沖模將粉末壓制為片芯，片芯質(zhì)量100 mg，其中杜仲葉提取物42 mg。將HPMC、碳酸氫鈉、乳糖、微粉硅膠、微晶纖維素按一定比例均勻混合作為包衣層材料，備用。將一半包衣材料置于10 mm 沖模中，鋪平，速釋片芯置于包衣材料中間，然后將剩余一半包衣材料加入沖模中，調(diào)整壓力進行壓片制得杜仲漂浮型脈沖釋放片。

2.2 杜仲漂浮型脈沖釋放片含量測定方法的建立

2.2.1

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取5 mg 綠原酸對照品至10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻備用。精密量取該儲備液配制成質(zhì)量濃度（C）為2，4，6，8，10，12，14，16，18 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mol/L 鹽酸溶液定容，取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于325 nm 波長處測吸光度（

A

），以質(zhì)量濃度（

C

）對

A

作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)方程

A

=0.0482

C

+0.0066，

r

=0.9997。表明綠原酸質(zhì)量濃度在2～18 mg/L 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2

體外釋放度測定及數(shù)據(jù)處理 釋放度的測定按《中華人民共和國藥典（2015年版）》四部通則溶出度測定法項下第二法漿法操作，以0.1 mol/L 鹽酸溶液為溶出介質(zhì)，溫度（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速50 r/min，按照設(shè)定時間點取樣，于325 nm處測定

A

，計算累積釋放率。對于脈沖釋藥系統(tǒng)，釋藥時滯通常是指藥物累積釋放百分率達(dá)10% 的時間。本研究采用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0 對時滯前后藥物釋放百分率進行l(wèi)ogistic 方程擬合，并根據(jù)擬合方程計算釋藥時滯。起漂時間為漂浮型脈沖釋放片放入溶出介質(zhì)中至完全漂浮在溶出介質(zhì)表面的時間。

2.3 星點設(shè)計-效應(yīng)面法的試驗設(shè)計和結(jié)果

在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，選取對藥物累積釋放影響較顯著因素：包衣層處方中HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X）所占包衣層質(zhì)量的百分比（%）為考察因素，采用Design-Expert 8.06 軟件安排3 因素5 水平的試驗設(shè)計，各考察因素水平代碼值及其水平的具體取值見表1；以釋藥時滯Y（h）和起漂時間Y（s）為考察指標(biāo)；試驗設(shè)計安排及結(jié)果見表2。

表1 杜仲漂浮型脈沖釋放片星點設(shè)計因素水平表/%

表2 杜仲漂浮型脈沖釋放片星點實驗設(shè)計與結(jié)果

采用Design-Expert 8.06軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行處理及效應(yīng)面法處方優(yōu)化，分別以釋藥時滯（Y）和起漂時間（Y）為因變量，以包衣層處方中HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X）所占包衣層質(zhì)量的百分比為自變量進行多元線性和二次多項式方程擬合，多元線性回歸方程：Y=8.32981+0.15768X-0.16931X-0.23185X（

P

＜0.0001，

R

=0.8110），Y=470.29775-0.42226X-2.50257X-15.13642X（

P

＜0.0004，

R

=0.6651）；二次多項式方程：Y=-9.09992+1.28581X-0.20171X-0.10055X-0.003634 41XX-0.016357XX+0.021035XX-0.012138X-0.006981 59X-0.001531 98X（

P

＜0.0001，

R

=0.9655），Y=1729.01264-27.13323X-29.38339X-79.1623X+0.55192XX-0.018773XX-0.048809XX+0.26747X+0.28249X+1.63913X（

P

＜0.0001，

R

=0.9668）。由擬合方程結(jié)果可知，多元線性方程相關(guān)系數(shù)低，預(yù)測性差（

R

為0.8110 和0.6651），二次多項式方程的擬合度均大于多元線性回歸方程（

R

為0.9655 和0.9668），Y和Y模型均

P

＜0.0001，說明兩個模型擬合較好。 另外，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X），XX，XX，X對釋藥時滯具有顯著性影響，乳糖（X）、碳酸氫鈉（X），X對起漂時間具有顯著性影響（

P

＜0.05）。根據(jù)二次多項式擬合方程，采用Design-Expert 8.06設(shè)計軟件，繪制兩因素對各評價指標(biāo)的三維效應(yīng)面圖，結(jié)果見圖1。

圖1 包衣層中各因素用量對杜仲漂浮型脈沖釋放片釋藥時滯和起漂時間影響的三維效應(yīng)面：1A為羥丙甲纖維素（HPMCK15M）（X1）、乳糖（X2）對釋藥時滯的影響；1B為HPMCK15M（X1）、乳糖（X2）對起漂時間的影響；1C為HPMCK15M（X1）、碳酸氫鈉（X3）對釋藥時滯的影響；1D為HPMCK15M（X1）、碳酸氫鈉（X3）對起漂時間的影響；1E為乳糖（X2）、碳酸氫鈉（X3）對釋藥時滯的影響；1F為乳糖（X2）、碳酸氫鈉（X3）對釋藥時滯的影響 圖2 驗證杜仲漂浮型脈沖釋放片優(yōu)化處方的體外釋藥曲線（n=6）

2.4 效應(yīng)面分析預(yù)測與處方優(yōu)化

釋藥時滯（Y）和起漂時間（Y）是影響杜仲漂浮型脈沖釋放片處方研究的重要因素，高血壓在凌晨時癥狀較為嚴(yán)重，該研究設(shè)計的杜仲漂浮型脈沖釋放片臨睡前服用，遇到胃液后迅速漂?。?0 s）起來，并持續(xù)一段時間（6 h）后藥物迅速釋放，以保證在疾病發(fā)作時藥物能充分釋放和吸收，發(fā)揮最佳治療效果。根據(jù)Design-Expert 8.06 軟件預(yù)測結(jié)果，HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X）所占包衣層質(zhì)量的百分比為35.21、20.17 和19.93。結(jié)合研究的實際情況（釋藥時滯=6 h，起漂時間=60 s），最終優(yōu)化處方為HPMC（X）、乳糖（X）、碳酸氫鈉（X）所占包衣層質(zhì)量的百分比為35%、20%和20%。

2.5 處方驗證

根據(jù)效應(yīng)面法優(yōu)化包衣層的最佳處方為：HPMC、乳糖、碳酸氫鈉分別占包衣層質(zhì)量的35%、20%、20%，微粉硅膠2%，其余微晶纖維素填充，包衣層質(zhì)量0.25 g。制備了3批杜仲漂浮型脈沖釋放片進行處方驗證，結(jié)果表明釋藥時滯實測值與預(yù)測值偏差+1.94%，起漂時間實測值與預(yù)測值偏差-3.77%，按此優(yōu)化處方制得的杜仲漂浮型脈沖釋放片在60 s時迅速起漂，并在一定時滯（約6 h）后藥物脈沖釋放，達(dá)到預(yù)期效果，結(jié)果見表3，體外釋放曲線圖見圖2。說明本實驗所擬合方程較好地描述指標(biāo)與因素之間的關(guān)系，擬合效果良好，可信度高。偏差=（預(yù)測值-實測值）/預(yù)測值×100%。

表3 杜仲漂浮型脈沖釋放片優(yōu)化處方預(yù)測值與實測值的比較（n=3）

3 討論

本研究杜仲漂浮型脈沖釋放片在預(yù)實驗基礎(chǔ)上通過考察體外溶出和膨脹性確定片芯中崩解劑為交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，占片芯質(zhì)量的10%，微晶纖維素和微粉硅膠填充，包衣層質(zhì)量0.25 g。通過單因素實驗表明HPMC對脈沖釋放片釋藥時滯的影響顯著，當(dāng)HPMC、乳糖、碳酸氫鈉分別占包衣層質(zhì)量的40%、20%、20% 時，藥物經(jīng)過6 h左右的時滯期后，藥物迅速釋放，采用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0對時滯前后藥物累積釋放百分率進行l(wèi)ogistic 方程擬合，計算釋藥時滯為6.5432，當(dāng)用量超過40% 后，脈沖釋放片的釋藥時滯會顯著增加，同時藥物釋放緩慢，無法實現(xiàn)脈沖釋放的設(shè)計要求。因此在進行星點設(shè)計時，HPMC的范圍定在20%～40%。

星點設(shè)計效應(yīng)面法是近年來國內(nèi)外常采用的制劑處方工藝研究的方法，通過非線性模型擬合實驗數(shù)據(jù)從而優(yōu)化處方，其特點在于實驗次數(shù)少，直觀，精密度高，應(yīng)用方便，預(yù)測值與真實值更接近。本研究依據(jù)星點設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化包衣層的最佳處方為：HPMC、乳糖、碳酸氫鈉分別占包衣層質(zhì)量的35%、20%、20%，微粉硅膠2%，其余微晶纖維素填充。釋藥初期包衣層材料中碳酸氫鈉和胃液起反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳，二氧化碳黏附在包衣層材料中使脈沖釋放片迅速漂浮在胃液中，凝膠材料HPMC吸水形成凝膠層，使水分難以滲透進入片芯，所以釋藥初期藥物基本不釋放。隨著釋藥過程的進行，包衣層中碳酸氫鈉的減少，乳糖逐步溶解形成孔道，水分加速滲透進入片芯，片芯中的藥物通過凝膠層溶解擴散開始有少量釋放，隨著凝膠材料的不斷溶蝕，崩解劑吸水片芯開始膨脹，其膨脹力越來越強，當(dāng)膨脹力撐破凝膠層后藥物迅速釋放，實現(xiàn)了藥物在體內(nèi)滯留一定時間后脈沖釋藥的目標(biāo)，避免了制劑脈沖釋放時藥物已通過吸收部位的問題，保證了藥物的吸收，達(dá)到定時定位的目的。

高血壓病人血壓波動的高峰常發(fā)生于凌晨，病人服藥不方便，特別是老年高血壓病人更易引發(fā)動脈粥樣硬化等慢性疾病。杜仲葉資源豐富，有明顯的降壓作用，但未得到有效的開發(fā)利用，成藥品種少，本研究以杜仲葉提取物為原材料制得的杜仲漂浮型脈沖釋放片在胃內(nèi)滯留一段時間，外層包衣層材料經(jīng)過骨架擴散溶蝕，片芯遇水后開始迅速崩解釋放藥物，達(dá)到了病人在臨睡前服用藥物，凌晨血壓升高時釋放藥物，使血藥濃度快速升高，及時控制疾病癥狀的目的。為杜仲葉的臨床應(yīng)用提供了參考，為杜仲漂浮型脈沖釋放片的體內(nèi)釋放特性及體內(nèi)外相關(guān)性研究提供了依據(jù)。

（本文圖1，2見插圖12-1）