Tyrosinase和Nestin及CD34在非典型黑素痣組織中的表達(dá)及臨床意義

[摘要]目的：探討Tyrosinase、Nestin及CD34在非典型黑素痣組織中表達(dá)及意義。方法：收集2012年1月-2019年10月52例非典型黑素痣組織及20例正常皮膚組織。采用EnVision二步法檢測(cè)Tyrosinase、Nestin、CD34的表達(dá)。結(jié)果：Tyrosinase和Nestin在交界痣中陽(yáng)性率為100.0%和0.0%，復(fù)合痣中表皮、真皮淺層及真皮深層組織陽(yáng)性率分別為100.0%，68.4%，0.0%;0.0%，10.5%，89.5%，皮內(nèi)痣中真皮淺層及真皮深層組織陽(yáng)性率分別為88.2%，0.0%;29.4%，88.2%，正常皮膚組織陽(yáng)性率為100.0%，15.0%。非典型黑素痣細(xì)胞不表達(dá)CD34，正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD34呈強(qiáng)陽(yáng)性。復(fù)合痣和皮內(nèi)痣表皮組織痣細(xì)胞Tyrosinase陽(yáng)性率顯著高于真皮深層組織（P=0.0300，0.0001）;復(fù)合痣和皮內(nèi)痣真皮淺層痣細(xì)胞Nestin陽(yáng)性率顯著低于真皮深層組織（P=0.0001，0.0020）。復(fù)合痣和皮內(nèi)痣的真皮淺層痣細(xì)胞中Tyrosinase和Nestin高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0010，0.0020）;復(fù)合痣和皮內(nèi)痣的真皮深層痣細(xì)胞中Nestin與Tyrosinase高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0000，0.0001）。結(jié)論：非典型黑素痣從表皮、真皮淺層到真皮深層Tyrosinase陽(yáng)性率逐漸降低，Nestin陽(yáng)性率逐漸增加，不表達(dá)CD34，Tyrosinase/Nestin的表達(dá)趨勢(shì)可解釋黑素細(xì)胞前體分化、遷移過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]非典型黑素痣;酪氨酸酶;巢蛋白;CD34;干細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]R739.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）10-0014-04

Expression and Clinical Significance of Tyrosinase， Nestin and CD34 in Dysplastic Melanocytic Nevi

CHEN Zhao-hui

（Department of Dermatology，the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830064，Xinjiang，China）

Abstract： Objective? To investigate the expression and significance of Tyrosinase， Nestin and CD34 in dysplastic melanocytic nevi. Methods? 52 cases of dysplastic melanocytic nevi and 20 cases of normal skin tissue from January 2012 to October 2019 were collected. The expression of Tyrosinase， Nestin and CD34 were detected by EnVision two-step method. Results? The positive rate of Tyrosinase， Nestin was 100.0%， 0.0% in junctional nevi. The positive rate of Tyrosinase， Nestin were 100.0%， 0.0% in epidermis， 68.4%， 10.5% in superficial dermis and 0.0%， 89.5% in deep dermis of compound nevi. The positive rate of Tyrosinase， Nestin were 88.2%， 29.4% in superficial dermis and 0.0%， 88.2% in deep dermis of intradermal nevi. The positive rate of Tyrosinase， Nestin was 100.0%，15.0% in normal skin tissue. All junctional， compound， and intradermal nevi were negative for CD34 within nevus cells， while normal skin tissues were strongly positive for CD34 in vascular endothelial cells. The positive rate of Tyrosinase in epidermal tissue of compound and intradermal nevi was significantly higher than that in deep dermis （P=0.0300， 0.0001）. The positive rate of Nestin in superficial dermal nevocytes of compound， intradermal nevi was significantly lower than that in deep dermal nevocytes （P=0.0001， 0.0020）. The high expression rates of tyrosinase and nestin in superficial dermal nevus cells of compound nevus and intradermal nevus were statistically significant （P=0.0010， 0.0020）. There was significant difference in the high expression rate of nestin and tyrosinase in deep dermal nevus cells of compound nevus and intradermal nevus （P=0.0000， 0.0001）. Conclusion? The positive rate of tyrosinase and Nestin in dysplastic melanocytic nevi decreased gradually from epidermis， superficial dermis to deep dermis， while the positive rate of Nestin increased gradually. The expression trend of tyrosinase/Nestin can explain the process of melanocyte precursor differentiation and migration.

Key words： dysplastic melanocytic nevi; Tyrosinase; Nestin; CD34; stem cells

非典型黑素痣（Dysplastic melanocytic nevi）是惡性黑素細(xì)胞瘤的惡性前病變，分為皮內(nèi)痣、交界痣及混合痣。惡性黑素細(xì)胞瘤與良性痣需要使用免疫組織化學(xué)鑒別[1]。雖然一些黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記物可用于區(qū)別良惡性[2-3]，但這些標(biāo)記物靈敏度、特異度差，因此尋找到一種更具價(jià)值的標(biāo)記物迫在眉睫。酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是黑素細(xì)胞成熟過(guò)程中的主要黑色素生成酶，也是黑素細(xì)胞分化程度的特異性標(biāo)記物。研究發(fā)現(xiàn)，表皮或淺表真皮痣細(xì)胞高表達(dá)酪氨酸酶，而深層皮膚小痣細(xì)胞低表達(dá)酪氨酸酶[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[5]。Nestin、CD34作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，在神經(jīng)脊干細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞高表達(dá)[6]。但是黑素細(xì)胞痣如何轉(zhuǎn)變?yōu)楹谒丶?xì)胞瘤的研究知之甚少。因此，本研究檢測(cè)了獲得性非典型黑素痣及正常皮膚組織中Tyrosinase、Nestin及CD34的表達(dá)，以期為黑素細(xì)胞瘤的早期診斷尋找到一種標(biāo)記物。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：收集2012年1月-2019年10月在筆者醫(yī)院明確診斷為非典型黑素痣的52例患者的病理及臨床資料。所有標(biāo)本均取自手術(shù)或活檢。其中交界痣16例，復(fù)合痣19例和皮內(nèi)痣17例;部位：背部40例，下肢3例，上肢3例，頭頸部6例;男30例，女22例;年齡15～73歲，平均（40.5±9.3）歲。選取同期正常人群20例為對(duì)照組，男11例，女9例;年齡15～67歲，平均（39.2±8.4）歲。正常皮膚標(biāo)本取自眼瞼、外耳道和胸部。陽(yáng)性對(duì)照乳腺癌標(biāo)本來(lái)自筆者醫(yī)院病理科保存標(biāo)本。本研究得到了入選對(duì)象的知情同意，并征得醫(yī)院倫理道德委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化檢測(cè)Tyrosinase、Nestin及CD34蛋白表達(dá)：制備4μm厚連續(xù)切片，脫蠟并修復(fù)抗原，采用EnVision二步法檢測(cè)Tyrosinase、Nestin、CD34的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，加入兔抗人Tyrosinase、Nestin、CD34多克隆一抗（1：100，1：100，1：50），4℃冰箱過(guò)夜，PBS洗滌后加入二抗，PBS洗滌，DAB顯色，水洗，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，封片。陽(yáng)性對(duì)照采取乳腺癌切片， 陰性對(duì)照用正常血清代替抗體。免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，兔抗人Tyrosinase、Nestin、CD34多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，鼠抗兔單克隆二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Tyrosinase、Nestin、CD34蛋白定位于細(xì)胞漿，均以胞質(zhì)呈紅色為陽(yáng)性染色細(xì)胞。高倍鏡下選取5個(gè)隨機(jī)視野，觀察1 000個(gè)細(xì)胞，按照陽(yáng)性細(xì)胞比例分為：<10%（0分）;10%～49%（1分）;50%～89%（2分）;≥90%（3分）。按照陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度分為：陰性（0分）;弱陽(yáng)性（1分）;中等陽(yáng)性（2分）;強(qiáng)陽(yáng)性（3分）。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例×陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度，規(guī)定0～6分為低表達(dá)，7～12分為高表達(dá)。所有切片均由病理科副主任醫(yī)師以上職稱的同一醫(yī)生雙盲閱片，重復(fù)三次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用（n，%）表示，χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。采用四格表對(duì)Tyrosinase和Nestin表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 Tyrosinase、Nestin、CD34蛋白表達(dá)情況：Tyrosinase蛋白在黑素細(xì)胞痣組織中呈巢狀或團(tuán)狀分布。16例交界痣中Tyrosinase陽(yáng)性率為100.0%，陽(yáng)性細(xì)胞位于表皮真皮交界處，呈團(tuán)狀分布（見圖1）;19例復(fù)合痣中表皮、真皮淺層及真皮深層組織Tyrosinase陽(yáng)性率分別為100.0%，68.4%，0.0%，染色強(qiáng)度逐漸減弱（見圖2）;17例皮內(nèi)痣中真皮淺層及真皮深層組織Tyrosinase陽(yáng)性率分別為88.2%，0.0%，染色強(qiáng)度逐漸減弱（見圖3）。20例正常皮膚組織中Tyrosinase陽(yáng)性率為100.0%，陽(yáng)性細(xì)胞位于表皮基底層，呈巢狀分布（見圖4）。

16例交界痣中Nestin陽(yáng)性率為0.0%（見圖1）;19例復(fù)合痣中表皮、真皮淺層及真皮深層組織Nestin陽(yáng)性率分別為0.0%，10.5%，89.5%，染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（見圖2）;17例皮內(nèi)痣中真皮淺層及真皮深層組織Nestin陽(yáng)性率分別為29.4%，88.2%，染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（見圖3）。正常皮膚組織及獲得性非典型黑素痣血管周圍可見Nestin強(qiáng)陽(yáng)性（見圖4B，5A）。獲得性非典型黑素痣毛囊的隆突部位Nestin強(qiáng)陽(yáng)性（見圖5A）。

獲得性非典型性黑素細(xì)胞不表達(dá)CD34，而在血管內(nèi)皮細(xì)胞、痣巢周圍結(jié)締組織的基質(zhì)細(xì)胞及毛囊的隆突部位可觀察到CD34的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（見圖5B，6）。正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD34呈強(qiáng)陽(yáng)性（見圖4C）。

復(fù)合痣和皮內(nèi)痣表皮組織Tyrosinase陽(yáng)性率顯著高于真皮深層組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0300，0.0001）。復(fù)合痣和皮內(nèi)痣真皮淺層Nestin陽(yáng)性率顯著低于真皮深層組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0001，0.0020）。見表1。

3? 討論

酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是一種含雙核金屬銅的氧化還原酶，是黑色素合成過(guò)程的限速酶。研究顯示，酪氨酸酶在黑素瘤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度隨黑素瘤的惡性程度的提高而增加[7]。另外研究表明，黑素瘤患者外周血Tyrosinase水平高于正常人群，與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)[8]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了交界痣、復(fù)合痣和皮內(nèi)痣組織Tyrosinase的表達(dá)，結(jié)果顯示，Tyrosinase在交界痣組織中陽(yáng)性率最高，復(fù)合痣次之，皮內(nèi)痣最低?，F(xiàn)已證實(shí)，部分黑素瘤是由黑素細(xì)胞痣惡變而來(lái)，交界痣比皮內(nèi)痣易惡變，本研究結(jié)果提示Tyrosinase可能與痣細(xì)胞惡變過(guò)程有關(guān)，通過(guò)檢測(cè)Tyrosinase可早期預(yù)測(cè)痣細(xì)胞的惡變。

惡性黑素瘤是起源于神經(jīng)嵴的黑素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤中存在一定數(shù)量的腫瘤干細(xì)胞，在黑素瘤發(fā)育前期，腫瘤干細(xì)胞周期進(jìn)行的非常緩慢，稱為惡變前腫瘤干細(xì)胞[9]。這群細(xì)胞受到紫外線照射、損傷等作用后可發(fā)生突變，形成惡性黑素瘤干細(xì)胞。Nestin作為神經(jīng)來(lái)源干細(xì)胞的標(biāo)記物，在多種腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)，Akiyama等發(fā)現(xiàn)，CD133和Nestin在惡性黑素瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率均高于黑素細(xì)胞痣[10]。Tyrosinase是黑素細(xì)胞成熟的標(biāo)記物，而Nestin則提示黑素細(xì)胞不成熟的標(biāo)記物，本研究結(jié)果顯示，表皮和真皮淺表痣細(xì)胞中Tyrosinase高表達(dá)，Nestin低表達(dá)，而真皮深層痣細(xì)胞Tyrosinase低表達(dá)，Nestin高表達(dá)，存在一定的相關(guān)性，提示Tyrosinase和Nestin可作為從多能性黑素細(xì)胞前體到成熟黑素細(xì)胞的標(biāo)記物，據(jù)此筆者推測(cè)黑素細(xì)胞痣中Tyrosinase/Nestin的分布可以作為一種“病理組織學(xué)模式”來(lái)監(jiān)測(cè)痣細(xì)胞在病理性增殖的情況下的分化狀態(tài)。

正常皮膚組織中，雖然大多數(shù)細(xì)胞是分化成熟的黑素細(xì)胞，但仍有多能干細(xì)胞存在于真皮、毛囊的隆起區(qū)域和表皮中。最近研究發(fā)現(xiàn)，毛囊的突起區(qū)域存在一群神經(jīng)嵴來(lái)源的干細(xì)胞，在體外可分化為黑素細(xì)胞[11]。本研究結(jié)果顯示，毛囊突起區(qū)域的小細(xì)胞聚集物高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin和CD34，提示這群細(xì)胞可能是神經(jīng)嵴來(lái)源的黑素細(xì)胞干細(xì)胞的貯存庫(kù)。推測(cè)黑素細(xì)胞干細(xì)胞沿著周圍神經(jīng)或血管，在真皮和毛囊的突起區(qū)域聚集。這群細(xì)胞被激活后，如果不發(fā)生突變，則向表皮遷移，分化為正常黑素細(xì)胞;如果發(fā)生突變，他們會(huì)異常增殖和遷移，從而形成痣細(xì)胞，甚至惡變。

綜上所述，Tyrosinase、Nestin在交界痣、復(fù)合痣和皮內(nèi)痣不同部位表達(dá)有差異，Tyrosinase聯(lián)合Nestin檢測(cè)可用于黑素細(xì)胞瘤疑難病例的診斷。同時(shí)分析Tyrosinase、Nestin在黑素細(xì)胞痣中的分布可以提供一個(gè)“組織病理學(xué)模式”，有助于追蹤神經(jīng)嵴衍生的黑素細(xì)胞前體向其最終解剖和功能部位進(jìn)入的分化途徑。

[參考文獻(xiàn)]

[1]John R Lozada，F(xiàn)elipe C Geyer，Pier Selenica，et al.Massively parallel sequencing analysis of benign melanocytic naevi[J].Histopathology，

2019，75（1）：29-38.

[2]Caroline Bsirini，Bruce R Smoller.Histologic mimics of malignant melanoma[J].Singapore Med J，2018，59（11）：602-607.

[3]Ahn CS，Guerra A，Sangüeza OP.Melanocytic nevi of special sites[J].Am J Dermatopathol，2016，38（3）：867-881.

[4]Rong-Dih Lin，Mei-Chuan Chen，Yan-Ling Liu，et al.New whitening constituents from Taiwan-native pyracantha koidzumii： structures and tyrosinase inhibitory analysis in human epidermal melanocytes[J].Int J Mol Sci，2015，16（12）：28598-28613.

[5]蔡新玲，孫晉民，蔡冬梅，等.黑色素瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2016，22（5）：535-539.

[6]眭云鵬，簡(jiǎn)雪平，馬麗，等.惡性黑色素瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，35（22）：3591-3594.

[7]Da Hyun Lee，Sung Shin Ahn，Jung-Bong Kim，et al.Down-regulation of α-melanocyte-stimulating hormone-induced activation of the Pax3-MITF-Tyrosinase axis by sorghum ehanolic extract in B16F10 melanoma cells[J].Int J Mol Sci，2018，19（6）：1640.

[8]Sarmistha Mahanty，Ankush A Kawali，Shruthi Shirur Dakappa，et al.Aqueous humor tyrosinase activity is indicative of iris melanocyte toxicity[J].Exp Eye Res，2017，162：79-85.

[9]吳星，袁定芬.黑色素瘤干細(xì)胞標(biāo)志物研究及其相關(guān)治療：認(rèn)識(shí)與針對(duì)性[J].中國(guó)組織工程研究，2018，22（1）：152-157.

[10]Akiyama M，Matsuda Y，Ishiwata T，et al.Nestin is highly expressed in advanced-stage melanomas and neurotized nevi[J].Oncol Rep，2013，29（4）：1595-1599.

[11]周迪煒，陳壽松，馮俊明.5種免疫標(biāo)記物在鑒別良、惡性黑色素腫瘤中的作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2016，37（3）：82-84.

[收稿日期]2020-08-17

本文引用格式：陳趙慧.Tyrosinase和Nestin及CD34在非典型黑素痣組織中的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（10）：14-17.