瘢痕疙瘩組織中miR-22-5p的表達(dá)及與eIF4E的相關(guān)性研究

王榮坤　林簡

[摘要]目的：觀察瘢痕疙瘩組織中微小RNA-22-5p（miR-22-5p）和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eIF4E）的表達(dá)，分析其相關(guān)性及臨床意義。方法：選擇51例瘢痕疙瘩組織作為觀察組，51例增生性瘢痕組織作為對照組，51例正常皮膚組織作為正常對照組。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測三組中miR-22-5p的表達(dá)，應(yīng)用免疫組化法和Western Blot法檢測瘢痕疙瘩組織中eIF4E的表達(dá)。結(jié)果：觀察組中miR-22-5p的表達(dá)明顯低于對照組和正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-22-5p的表達(dá)在不同病變最大徑、增殖指數(shù)和有無家族史中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而在不同性別、年齡中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。瘢痕疙瘩中miR-22-5p與eIF4E呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：MiR-22-5p在瘢痕疙瘩中的表達(dá)下降，與臨床及病理特征有關(guān)，miR-22-5p與eIF4E可能具有協(xié)同負(fù)向作用。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩;增生性瘢痕;微小RNA-22-5p;真核細(xì)胞翻譯起始因子4E;相關(guān)性分析

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）10-0010-04

Expression Significance of miR-22-5p and Relationship with eIF4E in Keloid Tissue

WANG Rong-kun，LIN Jian

（Department of Dermatology & STD，Sanya People's Hospital，Sanya 572000，Hainan，China）

Abstract： Objective? To observe the expression of microRNA-22-5p （miR-22-5p） and eukaryotic translation initiation factor 4E（eIF4E） in keloid tissue， and analyze their correlation and clinical significance. Methods? 51 cases of keloid tissue were selected as the observation group， 51 cases of hypertrophic scar tissue were selected as the control group， 51 cases of normal skin tissue were selected as the normal control group. The expression of miR-22-5p was detected by real-time quantitative PCR （qRT-PCR） in three groups The expression of eIF4E was detected by immunohistochemistry and Western blot in keloid tissue. Results? The expression of miR-22-5p in the observation group was significantly lower than that in the control group and the normal control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. There were significant differences in the expression of mir-22-5p in the maximum diameter of different lesions， proliferation index and family history （P<0.05）. However， there was no significant difference in expression between different genders and ages （P>0.05）. Negative correlation was found between miR-22-5p and eIF4E in keloid. Conclusion? The expression of miR-22-5p is decreased in keloid， which is related to the clinical and pathological characteristics. MiR-22-5p and eIF4E may have synergistic negative effect.

Key words： keloid; hypertrophic scar; microRNA-22-5p; eukaryotic translation initiation factor 4E（eIF4E）; correlation analysis

瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中由于成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原過量沉積形成的增生性疾病，目前學(xué)者關(guān)注到分子遺傳因素異常對其形成具有調(diào)控作用[1]。真核細(xì)胞翻譯起始因子家族相關(guān)成員是近年關(guān)注到的與病理性瘢痕形成密切相關(guān)的因子，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞侵襲及膠原形成起作用，真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）是家族中的重要成員，近年其在腫瘤的侵襲性生長中的研究較多。學(xué)者發(fā)現(xiàn)eIF4E高表達(dá)可能與成纖維細(xì)胞增生性疾病密切相關(guān)[2]。eIF4E上游具有多種調(diào)控基因，通過生物信息檢索發(fā)現(xiàn)miR-22-5p可能是其調(diào)控的上游因子（見圖1），同時(shí)相關(guān)文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)miR-22-5p低表達(dá)可能是促進(jìn)細(xì)胞侵襲的重要因子[3]?；诖吮緦?shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qRT-PCR）檢測瘢痕疙瘩中miR-22-5p的表達(dá)，分析其表達(dá)的臨床意義，探討其與eIF4E表達(dá)的相關(guān)性，以期為研究瘢痕疙瘩的形成和進(jìn)展提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：選擇2018年1月-2020年9月確診為瘢痕疙瘩的51例患者作為觀察組，其中男27例，女24例，年齡20～56歲，中位年齡36歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病變超出原創(chuàng)口，邊緣呈“蟹足腫”樣突起，質(zhì)地硬，呈粉紅色或紫紅色，無彈性，血供差。鏡下可見較多的成纖維細(xì)胞，并可見嗜酸性透明樣膠原纖維，具折光性，膠原纖維方向較不規(guī)則，呈漩渦狀與周圍皮膚分界清楚，并經(jīng)病理醫(yī)師閱片后證實(shí)（見圖2），呈浸潤性生長，且無消退現(xiàn)象;②首次確診;③臨床及病理資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷有異議者;②切取組織前行放療者;③隨訪資料不全或家屬不同意觀察者。本組中選擇51例增生性瘢痕組織作為對照組，均取自皮膚燒傷患者行整形修復(fù)時(shí)的增生性瘢痕組織，其中男28例，女23例，年齡24～67歲，中位年齡38歲。選擇51例正常皮膚組織作為正常對照組，均取自皮膚表面或皮下良性腫物切除術(shù)時(shí)皮膚切緣處經(jīng)病理證實(shí)為正常皮膚組織的患者，其中男29例，女22例，年齡22～60歲，中位年齡37歲。標(biāo)本術(shù)后立即取材，置于-80℃冰箱中凍存待檢。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬簽定知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 qRT-PCR檢測miR-22-5p水平：應(yīng)用qRT-PCR法檢測miR-22-5p的表達(dá)。取術(shù)后留取的新鮮標(biāo)本約10g，應(yīng)用TRizol試劑提取總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，按照相應(yīng)qPCR試劑盒的說明書檢測miR-22-5p水平。MiR-22-5p上游引物：5'-GTATCACACGTTGCATCCTCT-3';下游引物：5'-GACTACGCACGGAACTACCCC-3'。以U6為內(nèi)參，引物上游：5'-GGAAGTAGCACCTGATACGTC-3'下游：5'-TTGGCTTGTACGAATCTTCCG-3'。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min;95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 10s，33個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線，于60℃～95℃進(jìn)行測定，條件設(shè)置為升溫幅度0.5攝氏度/次，5秒/次，采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)水平。

1.2.2 eIF4E表達(dá)的檢測：應(yīng)用免疫組化二步法檢測瘢痕疙瘩組織中eIF4E的表達(dá)。eIF4E購自上海碧云天生物技術(shù)公司。基于石蠟包埋組織，切取4μm切片，先行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇1：250的濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)均由同一病理科技師一次性完成，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟操作，行DAB顯色，同時(shí)設(shè)陽性對照和陰性對照。eIF4E的陽性部位是細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜。選擇5個(gè)400倍視野（熱點(diǎn)區(qū)）進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由兩位病理醫(yī)師雙盲閱片后得出。分別進(jìn)行陽性率和著色強(qiáng)度的記分。陽性率：≤5%記1分，6%～25%記2分，26%～50%記3分，>50%記4分。著色強(qiáng)度：無著色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。兩者相乘作為最終評分，分值為0～12分。以≤6分記為陰性，以>6分記為陽性，計(jì)算陽性率。

應(yīng)用Western Blot法檢測瘢痕疙瘩組織中eIF4E的表達(dá)。GAPDH為內(nèi)參。基于新鮮凍存組織。嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行蛋白提取、蛋白濃度測定、蛋白變性、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)膜、免疫雜交后，取出膜后加入超敏發(fā)光液，發(fā)光時(shí)間2min。X膠片盒曝光2min，顯影25s。應(yīng)用Image J分析，以eIF4E與GAPDH的比值作為相對表達(dá)量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 17.0完成，定量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行方差齊性檢驗(yàn)，兩組間的比較應(yīng)用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用方差分析;組間率的比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 三組間miR-22-5p表達(dá)比較：瘢痕疙瘩中miR-22-5p的表達(dá)量明顯低于對照組和正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖3。

2.2 miR-22-5p在不同臨床特征分組中表達(dá)比較：miR-22-5p的表達(dá)在不同病變最大徑、增殖指數(shù)和家族史中的表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而在不同性別、年齡的表達(dá)中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 瘢痕疙瘩中miR-22-5p與eIF4E的相關(guān)性：免疫組化法檢測到eIF4E的陽性率是15%～55%，平均為37.7%。相關(guān)分析顯示miR-22-5p與eIF4E呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.68，P=0.036）。Western Blot檢測到eIF4E的表達(dá)為0.5～2.6，平均為1.5。相關(guān)分析顯示miR-22-5p與eIF4E呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.58，P=0.044）。見圖4～5。

3? 討論

miRNAs是在RNA沉默和基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起作用的長度為19～24個(gè)核苷酸的小非編碼RNA[4]。最近研究報(bào)道，miRNAs參與多種疾病的形成，尤其是細(xì)胞生長、增殖及侵襲中。miRNAs參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，miRNAs的序列具有高度的物種保守性，其表達(dá)具有獨(dú)特的時(shí)間特異性和空間特異性[5]。人類基因的30%受miRNAs調(diào)節(jié)，每個(gè)miRNAs平均具有200個(gè)靶mRNA。有些miRNAs靶向參與細(xì)胞侵襲和浸潤性生長的mRNA，被稱為侵襲抑制miRNAs[6]。miRNAs主要通過靶向調(diào)控下游靶基因發(fā)揮生物學(xué)作用[7]。本研究前期參照腫瘤侵襲的研究，分析與侵襲性生長有關(guān)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)并篩選出miR-22-5p作為本研究關(guān)注的因子，同時(shí)應(yīng)用生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)miR-22-5p與eIF4E具有靶向結(jié)合位點(diǎn)。相關(guān)資料顯示具有侵襲性生長的病變組織中miR-22-5p低表達(dá)而eIF4E高表達(dá)[8-9]。miR-22-5p可能作為抑制細(xì)胞侵襲的因子發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。

本研究結(jié)果顯示瘢痕疙瘩中miR-22-5p的表達(dá)明顯低于對照組和正常對照組，提示miR-22-5p低表達(dá)是瘢痕疙瘩病變形成的重要分子因素。結(jié)果顯示miR-22-5p的表達(dá)在不同病變最大徑、增殖指數(shù)和家族史中的表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-22-5p低表達(dá)參與瘢痕疙瘩的生長過程，也預(yù)示miR-22-5p低表達(dá)患者具有家族遺傳傾向。研究顯示瘢痕疙瘩中miR-22-5p與eIF4E具有負(fù)相關(guān)性，提示二者具有負(fù)向協(xié)同作用，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了TargetScan數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的二者具有結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征。miR-22-5p有參與纖維化和成纖細(xì)細(xì)胞生長疾病的過程。miR-22-5p通過eIF4E調(diào)控瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了兩者的相關(guān)性，但是兩者是否具有靶向調(diào)控作用后續(xù)實(shí)驗(yàn)中要進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行直接驗(yàn)證，這可能是揭示瘢痕形成重要機(jī)理之一。近年學(xué)者對真核細(xì)胞翻譯起始因子家族的相關(guān)成員與瘢痕疙瘩的形成較為關(guān)注，并發(fā)現(xiàn)涉及多種分子生物學(xué)通路[11-14]，這些通路均與DNA、RNA及蛋白的表達(dá)失調(diào)有關(guān)。研究認(rèn)為翻譯失調(diào)是瘢痕疙瘩病變的基礎(chǔ)，翻譯起始是蛋白合成中最復(fù)雜的步驟之一，涉及多種翻譯起始因子和多種mRNA調(diào)控元件[15]。翻譯起始可以通過多種方式失調(diào)，其中最值得注意的是通過MAPK和PI3K/AKT/mTOR等信號通路直接導(dǎo)致翻譯失調(diào)，啟動纖維細(xì)胞的異常增生和膠原化。eIF4E在侵襲性腫瘤性病變中高表達(dá)，在機(jī)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有兩種啟動子，外部啟動子產(chǎn)物為eIF4E，但是當(dāng)其甲基化后則影響后續(xù)的轉(zhuǎn)錄作用[16]。miR-22-5p在正常皮膚中高表達(dá)可能是保護(hù)作用，防止膠原化的損傷[17-18]。miR-22-5p的作用途徑和通路可能更多，如對長鏈非編碼RNA MEG3的調(diào)控等[19]，因此miR-22-5p的功能表現(xiàn)為在多角度調(diào)控細(xì)胞的生長和侵襲中，進(jìn)行系統(tǒng)性細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)對詳細(xì)研究其功能有重要意義。

總之，miR-22-5p在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)下降，與臨床病理特征有關(guān)，miR-22-5p與eIF4E可能具有協(xié)同負(fù)向作用。

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[收稿日期]2020-10-09

本文引用格式：王榮坤，林簡.瘢痕疙瘩組織中miR-22-5p的表達(dá)及與eIF4E的相關(guān)性研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（10）：10-13.