拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌的分離與鑒定*

鄭艷艷 曹亞璞 王艷紅 郭小芳**

（1.西藏大學(xué)理學(xué)院，西藏 拉薩 850000；2.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會(huì)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091）

大棚果蔬的興起對于我們來說有著諸多益處，例如某些果蔬只在特定的季節(jié)才能在自然條件下進(jìn)行種植，這使其生產(chǎn)大大受到限制，自從有了大棚果蔬的種植，人們食用反季節(jié)果蔬成為現(xiàn)實(shí)；另一方面實(shí)現(xiàn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)增收，這同時(shí)也推動(dòng)了果蔬大棚的發(fā)展[1]。目前大棚條件下的微生物群落組成及其多樣性已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)，因?yàn)榇笈锓N植與自然露天種植相比，其生存環(huán)境有所改變，結(jié)果必將伴隨著該環(huán)境下微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。李玉娣等[2]研究表明陜西一果蔬大棚中的微生物總豐度與大棚棚齡呈正相關(guān)，并隨著大棚棚齡的增加而出現(xiàn)最大值。王陽等[3]同樣研究了蔬菜大棚土壤微生物的多樣性，結(jié)果表明其微生物多樣性隨著大棚棚齡的增加而增加。

青藏地區(qū)海拔高，氣候環(huán)境惡劣，果蔬的種植條件相對來說比較苛刻，因此該地區(qū)大棚果蔬的種植面積越來越大?，F(xiàn)在困擾種植農(nóng)戶的仍然是果蔬的病害威脅問題，導(dǎo)致此問題的因素有很多，在果蔬病害中，絕大部分的病害威脅是由于絲狀真菌的侵染所導(dǎo)致的。在果蔬的霉變過程中，最常見的霉菌就是青霉[4]。近年來，我國學(xué)者在果蔬真菌方面的研究也取得了一定的成果，杜公福等[5]對海南冬季蔬菜無性型真菌多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明海南島冬季蔬菜病害種類多，病原菌種類豐富。古佳妍等[6]對廣州地區(qū)的6 種野生蔬菜進(jìn)行了研究，結(jié)果明確了8 種病害真菌?，F(xiàn)今關(guān)于青藏地區(qū)大棚果蔬中絲狀真菌的研究鮮見報(bào)道，而且由于霉菌導(dǎo)致的果蔬腐爛變質(zhì)而引起的損失是不可估量的，且霉菌所產(chǎn)生的毒素往往嚴(yán)重影響人類的健康，因此開展果蔬中絲狀真菌的研究刻不容緩。開展拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬中絲狀真菌分離與鑒定的研究，以期為拉薩市果蔬病害的生物防治奠定基礎(chǔ)，并為構(gòu)建青藏地區(qū)絲狀真菌資源庫提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品果蔬及所在大棚概況

在拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)分別選取5個(gè)不同條件的大棚（不同棚齡、不同地理位置、不同果蔬品種）進(jìn)行供試果蔬的采集，果蔬樣品的具體概況如表1所示。

表1 果蔬品種及其所在大棚概況

1.2 樣品果蔬的采集

于拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)果蔬大棚中摘取11 種樣品果蔬，用無菌封口袋將其裝入后立即帶回實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)其中的絲狀真菌。

1.3 絲狀真菌的分離純化

將每種供試果蔬制得10-1與10-2的稀釋液并各取200μL 分別直接涂布于酸化YM 及酸化PDA 平板上，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。在室溫下培養(yǎng)3～5 天后選取菌落長勢較為均勻的平板記錄絲狀真菌菌落數(shù)，并將單菌落分別接于YPD斜面進(jìn)行純化。

1.4 絲狀真菌的分類鑒定

采用經(jīng)典分類法結(jié)合26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列分析法對獲得的絲狀真菌菌株進(jìn)行鑒定，將供試菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比來確定其地位。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對分離所得絲狀真菌的物種組成數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，采用R 3.6.3 對Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H’）、Simpson多樣性指數(shù)（D）、Pielou 均勻度指數(shù)（J’）及Jaccard相似度系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，繪圖采用Origin 2019b進(jìn)行。

2 結(jié)果 與分析

2.1 拉薩蔡公堂大棚果蔬絲狀真菌物種組成

2.1.1 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌種水平分析。從采樣果蔬大棚中共采集11種果蔬，對其進(jìn)行絲狀真菌的分離鑒定。研究結(jié)果表明11 種供試果蔬中共分離到49株絲狀真菌（僅西瓜中未分離到），對其進(jìn)行鑒定，將其歸為5屬12種。圖1結(jié)果表明，5個(gè)屬的絲狀真菌中，Cladosporium屬種類最多，為5 個(gè)種，其次是Mucor 屬，為3 個(gè)種，F(xiàn)usarium屬分離到2 個(gè)種，其余2 個(gè)屬Aspergillus與Penicillium則均僅分離到1個(gè)種。

圖1 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌種水平組成情況

分析12 種絲狀真菌在10 種供試蔬菜中的出現(xiàn)頻率，可以看出，F(xiàn)usarium sp.出現(xiàn)頻率最高，為50%；其次是Aspergillus tubingensis，出現(xiàn)頻率為40%；其中Cladosporium cladosporioides、Cladosporium sp.與Fusar?ium incarnatum等5 個(gè)種絲狀真菌僅在1 種果蔬中分離到，出現(xiàn)頻率均僅為10%.

不同種絲狀真菌相對豐度顯示，分離到的12種絲狀真菌中，Mucor circinelloides相對豐度最高，為22.45%；其次是Aspergillus tubingensis，相對豐度為14.29%.此外，Cladosporium sphaerospermum、Cladospo?rium tenuissimum與Cladosporium uredinicola等4 種 絲狀真菌的相對豐度均大于10%.因此，Aspergillus tubin?gensis、Fusarium sp.與Mucor circinelloides等6 個(gè)種均為拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬中絲狀真菌的優(yōu)勢種。

2.1.2 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌屬水平分析。圖2 數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)usarium 屬出現(xiàn)頻率最高（60%），在6 種供試果蔬中均被分離到；其次是Cladosporium屬（50%），在5 種供試果蔬中被分離到；而Penicillium屬的出現(xiàn)頻率僅為10%.

圖2 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌屬組成狀況

分析相對豐度可知，Cladosporium屬相對豐度最高，為36.73%；其次是Mucor，相對豐度為30.61%；Penicillium屬相對豐度最低，僅分離到1 株，相對豐度僅為2.04%.

2.2 拉薩蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌相似性分析

2.2.1 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌種水平相似性。圖3 數(shù)據(jù)表明，拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚不同果蔬間絲狀真菌種水平Jaccard相似性系數(shù)范圍為0～1。其中青椒與茄子、青椒與四季豆等6 組果蔬間相似性系數(shù)為0.75～1，為極相似水平，比例占13.33%；草莓與圣女果、草莓與玉米等7組果蔬間相似性系數(shù)為0.25～0.5，為中等不相似水平，比例占15.56%；草莓與番茄、草莓與青椒等32組果蔬間相似性系數(shù)為0～0.25，為極不相似水平，比例占71.11%.不同果蔬間絲狀真菌種水平Jaccard 相似性系數(shù)平均值為0.19，為極不相似水平。由此可知，拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚中供試果蔬表面絲狀真菌群落組成在種水平上存在較大差異。

圖3 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌種水平Jaccard相似度系數(shù)

2.2.2 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌屬水平相似性分析。圖4 數(shù)據(jù)表明，拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚不同果蔬間絲狀真菌屬水平Jaccard相似性系數(shù)為0～1。其中番茄與青椒、番茄與茄子等11組果蔬間相似性系數(shù)為0.75～1，為極相似水平，比例占24.44%；草莓與玉米、草莓與苦瓜等6 組果蔬間相似性系數(shù)為0.5～0.75，為中等相似水平，比例占13.33%；草莓與圣女果、草莓與紅椒等3 組果蔬間相似性系數(shù)為0.25～0.5，為中等不相似水平，比例占6.67%；草莓與番茄、草莓與青椒等25 組果蔬間相似性系數(shù)為0～0.25，為極不相似水平，比例占55.56%.不同果蔬間絲狀真菌屬水平Jac?card相似性系數(shù)平均值為0.38，為中等不相似水平。由此可知，拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚中供試果蔬表明絲狀真菌群落組成在屬水平上也存在一定差異。

圖4 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬絲狀真菌屬水平Jaccard系數(shù)

2.3 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬中絲狀真菌多樣性分析

圖5 數(shù)據(jù)顯示，供試的10 種果蔬中，絲狀真菌種數(shù)與屬數(shù)最多的均為草莓，種數(shù)與屬數(shù)分別為7 和5；其次是苦瓜，種數(shù)與屬數(shù)分別為6 和3；而番茄、青椒與茄子等5 種果蔬種類最少，種數(shù)與屬數(shù)均僅為1。總豐度數(shù)據(jù)表明，10 種果蔬中，圣女果中絲狀真菌總豐度最大，為2.5×105；其次是草莓、苦瓜與紅椒；相對而言，茄子中絲狀真菌的總豐度最小，為1×103。多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)表明，草莓的多樣性指數(shù)最高且分布最均勻，其次是苦瓜，而番茄、青椒與茄子等5 個(gè)品種果蔬的3種多樣性指數(shù)均為0。

圖5 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬中絲狀真菌多樣性分析

3 結(jié)論和討論

從采樣大棚基地采摘的11 個(gè)果蔬品種中共分離到49 株絲狀真菌，分子鑒定與經(jīng)典分類結(jié)果顯示，這些絲狀真菌菌株歸于5 個(gè)屬12 個(gè)種。Aspergillus tub?ingensis、Fusarium sp.與Mucor circinelloides等6個(gè)種均為拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬中絲狀真菌的優(yōu)勢種。其中Mucor circinelloides相對豐度最高，為22.45%.這些種屬的絲狀真菌幾乎均能導(dǎo)致果蔬的腐爛變質(zhì)。耿陽陽等［7］從霉變核桃中共分離出4 株病原絲狀真菌，主要為Mucor、Fusarium 與Aspergillus，該研究表明引起“紙皮核桃”發(fā)生腐爛變質(zhì)的主要絲狀真菌菌種為Mucor circinelloides等；關(guān)波等［8］研究表明導(dǎo)致新疆石河子地區(qū)甜櫻桃果實(shí)腐爛的致病真菌主要有Mu?cor fragilis、Fusarium sp.等；崔志婧等［9］對上海市銷售的進(jìn)口火龍果中的病害絲狀真菌進(jìn)行了分離與鑒定，研究結(jié)果表明該火龍果中兩種主要的致病霉菌均為Fusarium；張全黨等［10］對阿勒泰地區(qū)大豆主要栽培區(qū)大豆根腐病病株進(jìn)行了分離和鑒定，研究表明該地區(qū)大豆根腐病主要病原為Fusarium sp.；何祥祥［11］等為評估浙江地區(qū)基地溫棚和市售草莓的微生物污染情況開展了相關(guān)研究，對其中的絲狀真菌進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)果表明分離到的5株絲狀真菌為Mucor與Fusar?ium，總豐度為0～2900cfu/g。除此之外，有一些專家學(xué)者的研究結(jié)果與本文研究結(jié)果有著一定差異。有研究發(fā)現(xiàn)，草莓果實(shí)采后容易發(fā)生的霉菌病害主要有草莓灰霉病、草莓軟腐病等，分別由Botrytis cinerea、Rhi?zopus stolonifer及Colletotrichum acutatum等引起，此外，侵染采后草莓果實(shí)的病原真菌還有Mucor pirifor?mis、Mucor nucedo、Rhizopus spp.等［12］，但在本實(shí)驗(yàn)中卻分離出Mucor racemosus、Fusarium incarnatum、Penicil?lium olsonii、Cladosporium tenuissimum、Aspergillus tub?ingensis、Cladosporium uredinicola、Mucor circinelloides共5 屬7 種絲狀真菌。本研究玉米中分離到大量的Mucor circinelloides，而在對貯藏玉米絲狀真菌體系的研究中并未發(fā)現(xiàn)此類絲狀真菌。在拉薩蔡公堂中所采集的11 種供試蔬菜中，Cladosporium屬的絲狀真菌占比最多，而這類絲狀真菌是各種著斑病的主要病因。由于海拔、溫度、紫外線強(qiáng)度等條件，與內(nèi)地果蔬相比，拉薩果蔬表面所分離到的絲狀真菌有很大的差異。

研究結(jié)果顯示，11 個(gè)供試果蔬品種中只有1 個(gè)果蔬品種（西瓜）中未分離到絲狀真菌，其可能是因?yàn)椴烧^程中西瓜已經(jīng)下架，研究所選取的為已下架的西瓜，再加上青藏地區(qū)紫外輻射強(qiáng)，在陽光的強(qiáng)烈照射下，絲狀真菌無法繼續(xù)在西瓜中生存繁殖。此外，本研究發(fā)現(xiàn)同一蔬菜品種中的青椒和紅椒表面所分離得到的絲狀真菌無論是總豐度還是種類數(shù)上都存在著很大的差異，究其原因，可能是因?yàn)閮煞N蔬菜中所含營養(yǎng)成分有所不同，紅椒中各類元素常常高于青椒，且可溶性糖含量也相對較高［13］，這些原因可能都會(huì)導(dǎo)致這兩個(gè)品種中絲狀真菌的物種組成存在差異。

曹亞璞等［14］分析了拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬表面酵母菌，為了探討酵母菌與絲狀真菌之間是否存在相互制約關(guān)系，對其進(jìn)行了相關(guān)性分析。圖6 為拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬中所分離到的酵母菌多樣性指數(shù)與絲狀真菌多樣性指數(shù)間的相關(guān)性分析，從圖中可看出，拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬中酵母菌總豐度與絲狀真菌總豐度呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，除此之外，酵母菌屬數(shù)和酵母菌H’與絲狀真菌J’間均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。該分析結(jié)果表明，拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬中所分離得到的酵母菌與絲狀真菌間可能在一定程度上有著相互影響，但沒有呈現(xiàn)出相互抑制作用，可能與酵母菌和絲狀真菌對營養(yǎng)物質(zhì)的一致需求有關(guān)。

圖6 拉薩市蔡公堂鄉(xiāng)大棚果蔬中酵母菌與絲狀真菌間相關(guān)性分析

為了解絲狀真菌對拉薩蔡公堂果蔬的具體病害，筆者將會(huì)在后續(xù)對蔬菜病害的生物防治進(jìn)行研究，這對提高青藏高原地區(qū)的的果蔬質(zhì)量有著重要的意義。