玉米赤霉烯酮致肝臟損傷機制研究進展

王 萌，周鴻緣，桑 銳，葛冰潔，趙 欣，李春亭，張雪梅

(延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林延吉 133002)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)別名F-2毒素，首先從赤霉病玉米中提取出來，是一種真菌毒素，廣泛存在于霉變的玉米、小麥、燕麥和高粱等谷物及動物飼料中。ZEA毒性很強，能造成動物急慢性中毒，嚴重時毒素會殘留在動物組織中，引起動物機能異常甚至死亡。ZEA的分子質(zhì)量是318 u，熔點高，熱穩(wěn)定性好，高溫不易分解；ZEA在水和CC14中不易溶；易溶于NaOH等堿溶液，以及甲醇等有機溶劑中。ZEA通過食用被污染的肉類、奶類及污染谷類等動植物性食品等途徑進入機體，引起腹瀉、嘔吐、頭暈、乏力、四肢酸痛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等中毒癥狀。目前大部分國家制定了法律法規(guī)以限制谷物、食品和飼料中的ZEN含量，我國飼料衛(wèi)生標準規(guī)定了飼料中ZEA的含量要低于500 μg/kg，食品中真菌毒素的限量規(guī)定表明食品中ZEA不能超過60 μg/kg。但是全世界范圍內(nèi)的ZEA污染仍然存在，給動物和人類健康造成巨大的危害。在動物體內(nèi)，ZEA代謝為玉米赤霉烯醇 (ZEL)，且有α-ZEL和β-ZEL兩種異構(gòu)體，ZEA及其衍生物給人類和動物健康造成巨大威脅，表現(xiàn)在影響生長發(fā)育，破壞生殖系統(tǒng)、肝臟系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，造成氧化損傷，并引發(fā)腫瘤[1]。目前對ZEA生殖毒性的研究較多，但對肝臟毒性研究較少，本文針對ZEA引發(fā)肝臟損傷的機制研究進行了綜述。

1 ZEA致肝臟損傷

肝臟是機體內(nèi)主要的代謝解毒中心，極易受到有毒物質(zhì)的侵害。當ZEA進入機體被吸收后，肝細胞最先受到ZEA的影響。有研究表明，ZEA(1 mg/kg)會導致仔豬肝臟、腎臟的重量顯著增加[2]。Dong M等[3]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射ZEA的山羊體內(nèi)，肝臟細胞腫大以及淋巴細胞浸潤、腎臟淋巴浸潤。姜淑貞等[4]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量ZEA使斷奶仔豬血清膽紅素升高，肝細胞腫脹，顆粒變性、肝細胞膜上可見自噬體和中性粒細胞，表明ZEA導致肝臟功能嚴重損害。梁梓森等[5]研究也發(fā)現(xiàn)，感染的ZEA小鼠肝臟HE染色后可見肝細胞脂肪變性、局灶性壞死，表明ZEA能引發(fā)肝組織退化，造成肝損傷、肝功能紊亂。Gao X等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠ZEA染毒組出現(xiàn)肝小葉壞死，肝細胞變性和腫脹，同時肝臟氧化指標谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、總抗氧化能力(T-AOC)降低，MDA升高，表明ZEA誘導了肝損傷。Abbès S等[7]研究表明，在日糧中添加ZEA(40 mg/kg)的小鼠肝臟中觀察到的肝局灶性壞死，顆粒變性，腎小管上皮腫脹等；口服ZEA的家兔血清中檢測到天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、L-γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)和乳酸脫氫酶(LD)活性顯著增加，這表明ZEA的慢性作用可能會引起肝臟毒性。同時，ZEA會導致肝細胞中DNA及白蛋白含量下降，表明ZEA對大鼠肝細胞有損害作用[8-9]。

2 ZEA致肝損傷的機制

2.1 ZEA引起氧化應激損傷

Nrf2是細胞中與氧化應激有關(guān)的基本成分，為細胞抗氧化損傷的關(guān)鍵因子[4]。在氧化應激期間，Nrf2可以誘導各種保護蛋白如HO-1和NQO1的表達。一般情況下，Nrf2與其抑制蛋白Keap1以二聚體形式存在于細胞質(zhì)中，蛋白表達量處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。當受到外界氧化應激因子等刺激后，ROS升高，Nrf2與Keap1解離，增強了Nrf2的穩(wěn)定性并轉(zhuǎn)位進入細胞核，與小Maf等蛋白形成二聚體，活化的Nrf2與抗氧化反應元件(ARE)結(jié)合，從而啟動下游抗氧化基因HO-1、NQO-1等的表達，并發(fā)揮抗氧化活性(圖1)。因此，Nrf2信號通路的激活在機體抵御外源性或內(nèi)源性氧化應激中發(fā)揮重要作用[10]。其中，HO-1廣泛參與組織細胞的抗氧化應激損傷，是機體最重要的內(nèi)源性保護系統(tǒng)之一[11]。NQO-1是一種誘導還原酶，也是機體抵抗ROS的關(guān)鍵酶。有報道通過免疫組化方法成功檢測了糖尿病大鼠腎臟組織中HO-1、NQO-1和Nrf2的表達，發(fā)現(xiàn)HO-1和Nrf2水平顯著升高[10]。有研究檢測了HepG2細胞中HO-1、NQO-1和Nrf2的表達，發(fā)現(xiàn)ZEA能劑量依賴性下調(diào)Nrf2、HO-1和NQO1的表達[12]，表明ZEA誘導產(chǎn)生氧化應激。正常肝細胞(L02)染毒24 h后，低劑量組(5 μg/mL)ZEA能夠顯著提高細胞內(nèi)Keap1蛋白的表達，降低HO-1和NQO1蛋白表達，表明ZEA通過抑制抗氧化通路Nrf2-Keap1/ARE通路中部分基因的表達造成細胞氧化性損傷[13-14]。

圖1 ZEA通過氧化應激致肝損傷的機制

氧化應激是細胞和組織氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的失衡，是氧化自由基和相關(guān)活性氧(ROS)過量產(chǎn)生的結(jié)果[15]。ROS是由磷酸肌酸3-激酶(PI3K)/Akt通路誘導產(chǎn)生的，該通路可以觸發(fā)各種細胞內(nèi)反應。研究發(fā)現(xiàn)，ZEA可以下調(diào)pPI3K/pAkt激活，從而導致氧化應激[12]。PI3K/AKT信號通路是一條與增殖、分化和凋亡相關(guān)的信號通路。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成的二聚體，分為IA和IB兩個亞型，它們分別可以接收來自酪氨酸激酶連接受體和G蛋白偶聯(lián)受體傳遞的信號，能夠發(fā)揮類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性。AKT也叫做PKB，是PI3K的下游分子，包括AKT1、AKT2和AKT3等至少3種存在形式，在調(diào)控各種細胞生長代謝、增殖分化、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮重要作用。PI3K與生長因子受體(如EGFR)結(jié)合后，可改變Akt的蛋白結(jié)構(gòu)并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物如凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase-9活性，從而調(diào)節(jié)肝細胞的增殖、分化以及凋亡[12]。氧化應激與PI3K/AKT信號通路密切相關(guān)[16]。大量研究表明，PI3K/Akt等多種信號轉(zhuǎn)導機制使Nrf2游離于Keap1，并促進隨后的信號轉(zhuǎn)導誘導抗氧化酶的激活[17-18]，也表明持續(xù)的氧化應激導致PI3K/Akt信號的下調(diào)[19-21]。因此，調(diào)控PI3K/Akt信號通路可能是一種很有前景的預防ROS誘導肝細胞凋亡的策略。

2.2 ZEA誘導細胞凋亡

細胞凋亡是一種基本生物學現(xiàn)象，是細胞受損后應對機體損傷做出的一種主動的生理過程。凋亡受多基因嚴格控制，這些基因包括Bcl-2家族、caspase家族、抑癌基因p53等。凋亡是維持機體穩(wěn)態(tài)的過程，能夠提高免疫力，適應不良環(huán)境。正常凋亡不會引發(fā)炎癥，但一旦凋亡過度就會引起炎癥反應。ZEA誘導細胞凋亡的信號通路有很多，但主要誘導肝細胞凋亡的是線粒體凋亡信號通路(圖2)。

圖2 ZEA通過誘導細胞凋亡致肝損傷的機制

線粒體引發(fā)的內(nèi)在途徑參與了ZEA誘導的細胞凋亡過程。研究發(fā)現(xiàn)，ZEA作用細胞后可使細胞膜通透性增加并增加細胞內(nèi)鈣離子水平，造成ROS累積引發(fā)細胞DNA損傷，最終誘導HepG2細胞出現(xiàn)凋亡[22]。caspase-3、Bax、Bcl-2、p53參與調(diào)節(jié)細胞的凋亡過程。其中，caspase-3被稱為細胞凋亡的生化標志，被激活后能降解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。而Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C的釋放，具有凋亡作用。Bcl-2是進化相關(guān)蛋白家族。這些蛋白質(zhì)控制線粒體外膜透性(MOMP)，Bcl-2家族分為兩類，一類是抗凋亡的主要有Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w和Mcl-1，一類是促進凋亡的主要包括Bax、Bak和Bok等。Bcl-2可阻止凋亡形成因子如細胞色素C等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用。p53是人體腫瘤抑制基因，由p53基因編碼的蛋白質(zhì)調(diào)控細胞周期的啟動，p53介導的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑在調(diào)節(jié)細胞正常生命活動中起重要作用。并且p53可以上調(diào)Bax的表達水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達，從而促進細胞凋亡[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝細胞中用ZEA處理后，胞漿中的細胞色素C增加，并且caspase-9和caspase-3被激活。經(jīng)ZEA處理的肝組織中pPI3K、pAkt、Nrf2和Bcl-2蛋白質(zhì)含量下降，這表明ZEA通過氧化應激誘導凋亡[11]。同時，ZEA顯著抑制Bcl-2表達，并隨后提高了裂解caspase-3、caspase-9和PARP的凋亡標記蛋白的水平，進一步導致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細胞死亡[24]。另有相關(guān)研究表明，通過p53線粒體信號通路，ZEA會增加促凋亡因子/抗凋亡因子比值來誘導HepG2細胞中GSH和MMP水平下降[25]，表明ZEA通過將細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中的線粒體途徑和caspase-3與caspase-9介導的線粒體通路導致肝臟凋亡壞死。

2.3 ZEA與細胞自噬

在正常的生理條件下，細胞可以保持非常低的自噬水平。但當細胞受到各種應激條件，如營養(yǎng)缺失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和氧化應激時，為了生存，會自動觸發(fā)自噬。自噬可以通過幾種相互連接的信號通路觸發(fā)，包括MAPK家族、PI3K-AKT-mTOR和ADP/ATP-AMPK信號通路(圖3)。有研究表明，ERK和PI3K-Akt-mTOR信號通路參與了ZEA誘導的自噬過程。ERK信號通路通過抑制mTOR的磷酸化觸發(fā)TM4細胞的自噬[26,27]。Wang Y等[28]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠Leydig細胞暴露于ZEA后，上調(diào)了LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達，表明ZEA誘導產(chǎn)生自噬。馮楠楠等[29]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的ZEA可以通過PI3K/Akt/m TOR信號通路誘導睪丸支持細胞發(fā)生自噬。王雪[30]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA可以上調(diào)大鼠胰島β細胞中自噬相關(guān)蛋白的表達誘導自噬。目前，關(guān)于ZEA引起肝細胞自噬的機制研究尚不全面，因此研究ZEA的自噬機制仍有很大的空間。

圖3 ZEA誘導細胞自噬致肝損傷的機制

2.4 ZEA引發(fā)炎癥

有研究發(fā)現(xiàn)，ZEA感染的小鼠肝臟中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平明顯升高，肝臟存在廣泛的炎癥灶，嚴重壞死，間質(zhì)性水腫以及失去完整性，還發(fā)現(xiàn)了雙核肝細胞、正弦空間的血腫、正弦和中央靜脈的充血，以及肝細胞死亡[12]，表明ZEA與炎癥相關(guān)。ZEA感染的豬肝臟中促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β和IFN-γ的含量升高，抗炎因子IL-4的含量降低，IL-10含量無明顯變化，表明ZEA可以導致肝臟產(chǎn)生炎癥反應[31]。MMP是參與與細胞因子網(wǎng)絡密切相關(guān)的炎癥過程的重要分子，Pistol等研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9的含量，在喂食ZEA污染飲食的仔豬肝臟中有所下降，表明ZEA與炎癥相關(guān)。

3 展望

玉米赤霉烯酮產(chǎn)自于發(fā)生霉變的玉米、小麥等谷物中，毒性強，不易代謝，耐熱性強，高溫也不容易破壞，ZEA在飼料中的污染十分嚴重，飼料污染后可對畜牧場造成巨大的經(jīng)濟損失和安全隱患，而且目前還沒有安全有效環(huán)保的藥物能夠解決這一問題。因此，研究ZEA誘導肝損傷的具體機制有著極其重要的意義。目前對ZEA的研究大多集中在生殖系統(tǒng)方面，而對肝臟毒性的研究較少，個別研究集中在病理學方面。對肝臟的氧化應激與凋亡及其相關(guān)信號通路研究較少，本文就ZEA的氧化應激、凋亡自噬、炎癥方面做了綜述，旨在為探索綠色安全有效的藥物提供理論基礎，以期應用到ZEA中毒的臨床防治中，以保證動物及人類的健康。可以預見的是，今后有關(guān)ZEA及其衍生物的綜合毒性的相關(guān)研究將成為趨勢。