小鼠品系、性別及體重對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性評(píng)價(jià)的影響

任小俠，趙俊杰，彭國瑞，程君生，吳思捷，姚文生，王團(tuán)結(jié)

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

20世紀(jì)80年代初，豬丹毒、豬肺疫和豬瘟是困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著豬丹毒疫苗的廣泛使用，本病得到有效控制。近年來，豬丹毒作為人畜共患病呈現(xiàn)零星散發(fā)態(tài)勢，應(yīng)當(dāng)引起高度關(guān)注[1]。

目前，在我國經(jīng)批準(zhǔn)上市的豬丹毒疫苗有滅活疫苗和活疫苗。與滅活苗相比，豬丹毒活疫苗免疫原性更好，能引發(fā)機(jī)體更強(qiáng)的免疫保護(hù)。我國獸用生物制品簽發(fā)批次數(shù)據(jù)顯示， 2019年豬丹毒活疫苗簽發(fā)批次約占88.1%。在豬丹毒活疫苗生產(chǎn)和檢驗(yàn)中普遍存在一個(gè)共性問題：G4T10株活疫苗單苗或三聯(lián)苗在選擇小鼠進(jìn)行安全性檢驗(yàn)時(shí)，常發(fā)生因選擇不同品系小鼠出現(xiàn)安全性檢驗(yàn)結(jié)果不同的情況，導(dǎo)致無法確定產(chǎn)品質(zhì)量是否合格。若選擇用豬進(jìn)行檢驗(yàn)，相比使用小鼠檢驗(yàn)，成本大幅增加，浪費(fèi)不必要的人力物力。研究表明，小鼠的免疫反應(yīng)受遺傳因素控制或影響，如小鼠品系、性別或發(fā)育階段等因素。本研究以困擾豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性檢驗(yàn)問題為導(dǎo)向，系統(tǒng)探討了小鼠品系、性別等因素對(duì)其安全性檢驗(yàn)結(jié)果的影響，旨在發(fā)掘適用于當(dāng)前豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性檢驗(yàn)小鼠的關(guān)鍵信息，為相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂和生產(chǎn)檢驗(yàn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 馬丁肉湯、馬丁瓊脂，購自北京中海生物科技有限公司；豬丹毒活疫苗(G4T10株)(產(chǎn)品批號(hào)：1901003)，購自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司江西生物制品廠；200 mg/mL鋁膠生理鹽水，購自廣西麗原生物股份有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 不同品系(C57BL/6N、ICR、KM、Balb/c)、性別及體重SPF級(jí)小鼠，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 生物安全柜(型號(hào)NU-425-600B),NUAIRE公司產(chǎn)品；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)GNP-9270)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 活菌計(jì)數(shù) 隨機(jī)抽取3瓶該批疫苗，每瓶疫苗樣品用10.0 mL馬丁肉湯在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行復(fù)溶，用馬丁肉湯作為稀釋液進(jìn)行10倍系列稀釋。先取一系列試管，每一管加入9.0 mL稀釋液，然后準(zhǔn)確吸取菌液1.0 mL，放入盛有稀釋液的第1支試管，混合均勻后，另取1支試管吸取1.0 mL放入第2管，依次稀釋至最后1管。吸取最終稀釋度的菌液接種適宜的含100 mL/L血清的馬丁瓊脂培養(yǎng)基平板3個(gè)，每個(gè)平板滴入0.1 mL菌液，使菌液均勻散開，37 ℃正置晾干后，翻轉(zhuǎn)平板，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h。

菌落計(jì)算：肉眼觀察平板中的菌落，并在平板底面計(jì)數(shù)，算出3個(gè)平板的平均菌落數(shù)，計(jì)算出每頭份疫苗中含有的活菌數(shù)(CFU)。最終稀釋度選擇每個(gè)平板菌落數(shù)為40～200的稀釋度。

1.2.2 安全性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法 按照疫苗標(biāo)簽注明頭份，將疫苗用200 mg/mL氫氧化鋁膠生理鹽水稀釋，皮下注射體重20 g～22 g小鼠10只，每只注射2頭份，觀察14 d。注射G4T10疫苗的小鼠至少8只健活。否則，可用小鼠按照上述方法重檢1次，如果仍不符合規(guī)定，可用豬檢驗(yàn)1次[2]。

1.2.3 分組 不同品系小鼠對(duì)G4T10疫苗安全性檢驗(yàn)的影響： 4種品系小鼠分別為KM、Balb/c、C57BL/6N和ICR，分別按照上述檢驗(yàn)方法各注射2頭份、6頭份和10頭份， 每組10只小鼠，重復(fù)3次試驗(yàn)。同時(shí)，小鼠體重均位于20 g～22 g之間，全部為雌性。

不同性別小鼠對(duì)G4T10疫苗安全性檢驗(yàn)的影響：采用雌性和雄性ICR小鼠(體重20 g～22 g)，分別按照上述檢驗(yàn)方法各注射2頭份、6頭份和10頭份， 每組10只小鼠，重復(fù)3次試驗(yàn)。

不同體重小鼠對(duì)G4T10疫苗安全性檢驗(yàn)的影響：采用13 g、21 g和29 g雌性ICR和C57BL/6N小鼠，分別按照上述檢驗(yàn)方法各注射2頭份、6頭份和10頭份， 每組10只小鼠，重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 按照1.2.2所述，單次試驗(yàn)小鼠死亡數(shù)量不超過2只判定為合格,安全性檢驗(yàn)合格率=試驗(yàn)合格批次/3。小鼠死亡率=3次試驗(yàn)小鼠死亡總數(shù)/30。

2 結(jié)果

2.1 豬丹毒活疫苗(G4T10株)活菌計(jì)數(shù)

豬丹毒活疫苗(G4T10株)的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果分別為10.4×108CFU/頭份、12.7×108CFU/頭份、7.8×108CFU/頭份，以每批產(chǎn)品3瓶樣品中含活菌數(shù)的最小值為最終結(jié)果，符合《中華人民共和國獸藥典》(2015年版三部)中豬丹毒活疫苗活菌計(jì)數(shù)中每頭份疫苗中含G4T10活菌應(yīng)不低于5.0×108CFU的要求。

2.2 不同品系小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性評(píng)價(jià)的影響

接種6頭份和10頭份豬丹毒活疫苗(G4T10株)后，4種品系小鼠全部死亡；在2頭份劑量組，只有C57BL/6N品系小鼠能夠通過安全性檢驗(yàn)，合格率為100%。另外，隨著接種劑量增加，C57BL/6N小鼠死亡率從13.3%上升至93.3%(表1)。

表1 不同品系小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性評(píng)價(jià)的影響

2.3 不同性別小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性評(píng)價(jià)的影響

雌性或雄性的ICR小鼠在分別接種3種不同劑量的豬丹毒活疫苗(G4T10株)后死亡率達(dá)到96.7%～100%，安全性檢驗(yàn)合格率為0(表2)。

表2 不同性別ICR小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性評(píng)價(jià)的影響

2.4 不同體重小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性評(píng)價(jià)的影響

13 g～14 g、21 g～22 g和29 g～30 g共3個(gè)體重規(guī)格ICR小鼠安全性檢驗(yàn)合格率均為0。在29 g～30 g組ICR小組死亡率在83.3%～96.7%，其他各組死亡率為100%(表3)。

表3 不同體重ICR小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性評(píng)價(jià)的影響

同時(shí)，用3種體重規(guī)格的C57BL/6N小鼠進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，在13 g～14 g、17 g～18 g及21 g～22 g三組小鼠免疫2頭份豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性檢驗(yàn)合格率為100%，死亡率在6.7%～10%(表4)。

表4 不同體重C57BL/6N小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性評(píng)價(jià)的影響

3 討論

豬丹毒活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程由哈爾濱獸醫(yī)研究所和江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出，已經(jīng)多次修訂，用于規(guī)范和指導(dǎo)豬丹毒活疫苗的生產(chǎn)和檢驗(yàn)[3]。我國獸藥典(2015年版三部)也收錄了豬丹毒活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，G4T10株活疫苗安全性檢驗(yàn)10只小鼠至少8只健活。本研究比較了不同品系小鼠對(duì)合格豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性檢驗(yàn)結(jié)果的影響，ICR、KM小鼠死亡率均超過80%，不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。造成該標(biāo)準(zhǔn)不適用的主要原因可能在于生產(chǎn)用G4T10毒株毒力返強(qiáng)或變異。朱良全等[4]的研究結(jié)果表明， G4T10株菌落形態(tài)受培養(yǎng)基的質(zhì)量影響，菌落形態(tài)則影響小鼠的安全性試驗(yàn)結(jié)果。國外則按照不同細(xì)菌代謝特點(diǎn)設(shè)計(jì)合成培養(yǎng)基，成分相對(duì)穩(wěn)定，可在發(fā)酵過程中在線檢測、監(jiān)控和及時(shí)調(diào)整[5-6]。目前，我國獸藥典對(duì)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制已有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，但是還有部分指標(biāo)亟需完善。另外，生產(chǎn)企業(yè)對(duì)生產(chǎn)用毒株應(yīng)嚴(yán)格控制使用代次，確保生產(chǎn)用菌毒品種符合安全性要求。

在獸用生物制品檢驗(yàn)過程中，使用本動(dòng)物或者易感動(dòng)物進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)是驗(yàn)證獸用生物制品質(zhì)量是否合格的重要檢驗(yàn)環(huán)節(jié)之一。目前研究普遍認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)微生物的易感性或免疫反應(yīng)受其遺傳因素的控制，說明不同品系或者規(guī)格的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)不同微生物的易感性表現(xiàn)不同。為了解決豬丹毒活疫苗(G4T10株)小鼠安全性檢驗(yàn)問題，本研究系統(tǒng)比較了實(shí)驗(yàn)小鼠的品系、性別和體重等因素對(duì)G4T10株活疫苗安全性檢驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果證實(shí)，按照我國獸藥典豬丹毒活疫苗(G4T10株)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行其安全性檢驗(yàn)，C57BL/6N小鼠在注射2頭份劑量14 d后的健活數(shù)量符合檢驗(yàn)要求，可以通過安全性檢驗(yàn)，而Balb/c、ICR、KM 3種品系小鼠死亡率超過80%，不符合檢驗(yàn)要求。因此可見，不同品系小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)的易感性存在明顯差異，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果有重要影響。近年來，Balb/c-C57BL/6小鼠模型已被廣泛用于細(xì)菌感染的免疫病理研究，如Balb/c和C57BL/6小鼠對(duì)鼠痘病毒和類鼻疽伯克氏菌的免疫反應(yīng)不同[7-8]。在本研究中，C57BL/6N與其他品系小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)免疫反應(yīng)差異的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究還探索了小鼠性別和體重因素對(duì)豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性檢驗(yàn)的影響。ICR雌鼠和雄鼠并沒有在2頭份劑量豬丹毒活疫苗(G4T10株)免疫后表現(xiàn)出差異，可能是因?yàn)槎局甓玖^強(qiáng)或者性別因素差異不大，還需進(jìn)一步證實(shí)；而在體重因素的研究中則證實(shí)，13 g以上C57BL/6N小鼠均可通過豬丹毒活疫苗(G4T10株)安全性檢驗(yàn)，而ICR小鼠雖然隨著體重增加，其死亡率有所下降，但是仍然不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

因此，從本研究結(jié)果來看，建議從以下兩個(gè)方面加快推進(jìn)相關(guān)工作。一是全面評(píng)估豬丹毒活疫苗(G4T10株)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的適用性，對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)應(yīng)規(guī)定檢驗(yàn)上限，對(duì)安全性檢驗(yàn)用小鼠的品系等進(jìn)行明確要求；二是進(jìn)一步完善豬丹毒菌株生產(chǎn)檢驗(yàn)用培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。